[发明专利]一种密码子优化的玉足海参海藻糖酶基因及其应用

说明书

本发明公开了一种密码子优化的玉足海参海藻糖酶基因及其应用，属于基因改造与蛋白表达技术领域。本发明通过密码子优化技术对玉足海参的海藻糖酶基因进行改造后，在酵母表达系统中成功表达出具有海藻糖酶活性的蛋白，进而为人工养殖海参提供一种有助于摄食和消化的饲料调节剂，提高海参的摄食和消化吸收效率；同时，将该蛋白应用于大型海藻的精深加工，使海藻的营养得到更充分的释放与利用。

技术领域

本发明涉及基因改造与蛋白表达技术领域，具体涉及一种密码子优化的玉足海参海藻糖酶基因及其应用。

背景技术

玉足海参(Holothuria leucospilota)是我国南海海域的优势海参品种，在富、寡营养环境均能广泛分布。海洋藻类广泛存在于玉足海参的食物中，海藻糖(Trehalose)是海洋藻类重要的细胞骨架和贮藏物质，可以被海藻糖酶(Trehalase,Tre)水解为葡萄糖，为生命活动提供能量物质。玉足海参海藻糖酶(Hl-Tre)是到目前为止，在海洋动物尤其海参中唯一公开报道的海藻糖酶。前期的研究发现，海藻糖酶在玉足海参的食性转换和适应富、寡营养环境过程中，均可能起至关重要的作用。由于海藻糖酶的来源有限，目前没有商用化的海藻糖酶，且通过生化分离得率低、质控难，而化学合成成本高，因此需要通过基因工程手段建立Hl-Tre的高效制备方法。

相对于其它动植物或细菌来源的海藻糖酶，通过海参基因表达的海藻糖酶作为饲料调节剂更有助于提高人工养殖海参的摄食和消化吸收效率；同时，其还能以酶制剂的形式应用于大型海藻的精深加工，使海藻的营养得到更充分的释放与利用。

毕赤酵母是一种常用的甲基营养型酵母，以其为基础构建的毕赤酵母表达系统因遗传背景清楚，表达水平高，且具有良好的工业化性能而被广泛应用于各类生物活性蛋白的高效生产。目前常用的毕赤酵母表达系统主要采用的表达载体为pPIC9K，该载体含有一个甲醇诱导型的启动子AOX1，在发酵过程中需要甲醇做碳源和诱导剂；通过改造该载体的启动子，既能有效表达目的产物，同时可以避免甲醇诱导带来的不利影响。

在众多的基因改造技术中，密码子优化技术是目前应用较广泛的技术。密码子优化是基于氨基酸具有密码子简并性及不同物种密码子使用频率差异原则，通过改变基因序列中的多个适合在毕赤酵母表达系统中表达的密码子，而不改变原有的氨基酸序列，以确保表达的蛋白和内源分泌的蛋白具有相同的理化特性。

发明内容

本发明利用密码子优化技术对玉足海参的海藻糖酶基因进行了改造，改造后的玉足海参海藻糖酶基因在酵母表达系统中成功表达出具有海藻糖酶活性的蛋白。另外，由于甲醇具有对动物体有毒、易挥发、不利于发酵控制和易造成环境污染的缺点，而GAP启动子在葡萄糖等基本碳源存在的条件下，无需诱导即可高效地组成型表达外源基因，且在培养过程中，无需更换碳源，操作步骤更为简便，对于大规模的工业化生产及其友好。因此，本发明采用GAP启动子来构建玉足海参海藻糖酶的毕赤酵母组成型表达系统的载体。

本发明的第一个目的是提供一种密码子优化的玉足海参海藻糖酶基因，其特征在于，其核苷酸序列是以SEQ ID NO.1所示的序列为基础，作出以下(1)～(69)任意一项或多项的改变：

(1)将第2、17、23、42、45、61、71、84、111、114、122、154、203、264、312、365、427、455、490和517位氨基酸密码子GAT替换为GAC；

(2)将第3、102、130、158、361、371、373、396、397、420、494、496、497、504、510和527位氨基酸密码子GGA替换为GGT；

(3)将第4、43、60、299、310、384、439和493位氨基酸密码子CCT替换为CCA；

(4)将第6、147、207、265、300、425、464、532和535位氨基酸密码子CTT替换为TTG；