[发明专利]一种酶法制备N4-OH-CMP的方法

说明书

本发明属于酶催化技术领域，更具体的涉及酶催化磷酸化反应的方法。本发明中将磷酸根供体、金属离子加入水中，然后调节pH后加入酶、羟甲基结构的化合物酶催化反应得产物；尤其是采用NRK2催化N‑羟基胞苷制备N4‑OH‑CMP时，底物转化率可达95％以上，纯化N4‑OH‑CMP方法可以获得纯度98％以上的纯品，回收率95％以上。

技术领域

本发明属于酶催化技术领域，更具体的涉及酶催化磷酸化反应的方法。

背景技术

β-D-N4-羟基胞苷-5’-单磷酸脂(CAS：4988-54-9，简写：N4-OH-CMP)是一种广谱抗病毒药，由于其是抗新冠药N-羟基胞苷(CAS：3258-02-4)的磷酸化结构，更有利于体内的吸收利用，因此在治疗新冠方面，效果更佳。

目前N4-OH-CMP的制备方法为化学制备法，原料成本高；含盐量大，不利于纯化，尚无报道酶法合成N4-OH-CMP的方法。

发明内容

本发明提出了一种酶法催化羟甲基结构的化合物制备磷酸酯的方法，尤其是酶催化N-羟基胞苷的磷酸化制备N4-OH-CMP的方法，及其纯化N4-OH-CMP的方法。本发明方法底物转化率高，选择性高，产物易纯化。

本发明是通过如下技术方案实现上述目的的，一种酶法催化制备磷酸酯的方法，将磷酸根供体、金属离子加入水中，然后调节pH后加入酶、羟甲基结构的化合物酶催化反应得产物；所述酶为激酶(又称为磷酸化酶或磷酸转移酶)。

优选地，所述羟甲基结构的化合物为呋喃果糖或吡喃果糖中一个或多个羟基被取代的化合物，进一步优选为呋喃果糖中的一个羟基被取代的化合物。

优选地，所述呋喃果糖中的一个羟基被取代的化合物为N-羟基胞苷；即将磷酸根供体、金属离子加入水中，然后调节pH后加入酶、N-羟基胞苷，酶催化反应得产物N4-OH-CMP。

反应方程式如下：

优选地，所述磷酸根供体包括ATP、多聚磷酸、磷酸盐，所述磷酸盐为三聚磷酸钠、六偏磷酸钠、焦磷酸钠等；

优选地，所述金属离子包括Mg²⁺或Mn²⁺；浓度为反应体系质量的0.1-2％；

优选地，所述酶为激酶(又称为磷酸化酶或磷酸转移酶)；所述的酶优选的为NRK1(Nicotinamide riboside kinase 1(Homo sapiens))和NRK2(Nicotinamide ribosidekinase 2(Homo sapiens))；所述的激酶(又称为磷酸化酶或磷酸转移酶)的添加形式为酶液、酶粉、固定化酶或未破碎菌体；所述酶液加入量为反应体系质量的5-20％。

优选地，所述酶为NRK2(Nicotinamide riboside kinase 2(Homo sapiens))。尤其是采用NRK2催化N-羟基胞苷制备N4-OH-CMP时，收率较NRK1体现显著提高，起到了意料不到的技术效果。

优选地，所述酶催化反应的反应温度为10-60℃，进一步优选为25-40℃；

优选地，所述磷酸化反应的反应时间为1-24h。

优选地，所述酶催化反应得产物后采用离子交换树脂纯化；进一步优选地所述离子交换树脂包括强阴离子交换树脂和弱阳离子交换树脂；所述强阴离子交换树脂为D201、201*7；所述弱阳离子交换树脂为D113、110。

3、本发明所产生的技术效果。

(1)本发明提供了酶法合成N4-OH-CMP方法，底物转化率可达95％以上。

(2)本发明提供的纯化N4-OH-CMP方法可以获得纯度98％以上的纯品，回收率95％以上。