[发明专利]绵羊血液基因组DNA的提取方法及其应用、绵羊资源群体的遗传多样性评价方法

权利要求书

1.一种提取绵羊血液基因组DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)取绵羊血液200μL，加入到1.5mL的EP管中，加入20μL的蛋白酶K溶液后混匀，再加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃水浴锅中放置10min；

2)取出EP管，再加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，将所得溶液转移至吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液，向吸附柱CB3加入500μL的GD，12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液；

3)向吸附柱CB3加入600μL的漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液，重复一次向吸附柱CB3中加600μL的漂洗液PW、离心及倒掉废液；

4)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温数分钟，再转入一个新的EP管中，向吸附柱的中间部位悬空滴加洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12000rpm离心2min，EP管中的液体即为提取的DNA溶液，进行凝胶电泳检测后置于-20℃环境下保存备用。

2.权利要求1所述方法得到的绵羊血液基因组DNA在评价绵羊资源群体的遗传多样性中的应用。

3.一种绵羊资源群体的遗传多样性评价方法，其特征在于：包括以下步骤：

采集绵羊的血液样品；

利用权利要求1所述的方法提取血液样品的基因组DNA；

在微卫星标记数据库中筛选30对微卫星标记引物，分布于绵羊26对常染色体和X性染色体，并通过NCBI数据库验证引物序列，微卫星标记采用5-ROX、5'6-FAM(FITC)、5-TAMRA和5-HEX进行荧光标记；

PCR扩增及微卫星标记的等位基因分型；

统计分析及资源群体的遗传多样性评价，采用软件分析微卫星标记的杂合度和多态信息含量，按照衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标，即PIC0.50的标记为高度多态信息位点，PIC0.25的标记为低度多态信息位点，0.25＜P＜0.50的标记为中度多态信息位点，绵羊群体30个微卫星标记的遗传多态信息含量为0.3338～0.8660，其中7个标记为中度多态信息位点，23个标记为高度多态信息位点，群体的平均多态信息含量为0.6257，来表明绵羊资源群体具有丰富的遗传多态性。

4.根据权利要求3所述的绵羊资源群体的遗传多样性评价方法，其特征在于：所述采集步骤为：采用颈静脉采布拖黑绵羊的血3～4mL，注入加有抗凝剂肝素钠的一次性真空采血管中，随后将采血管180°颠倒混匀5-6次，置于低温保存箱中运输，带回实验室20°保存备用。

5.根据权利要求3所述的绵羊资源群体的遗传多样性评价方法，其特征在于：所述PCR扩增及等位基因分型的步骤为：使用试剂盒，25μL反应体系：2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，上、下游引物10mmol/L各1μL，DNA模板1μL，用超纯水补充至25μL，94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃-63℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸8min，扩增产物8℃保存。

6.根据权利要求3所述的绵羊资源群体的遗传多样性评价方法，其特征在于：所述软件为Cervus3.0软件。