[发明专利]嗜盐胆碱激酶突变体及其应用

说明书

本发明公开一种嗜盐胆碱激酶突变体，所述突变体由序列为SEQ ID NO:1的胆碱激酶突变而来。本发明的嗜盐胆碱激酶突变体M1‑M3相较于野生型的嗜盐胆碱激酶具有更高的催化活性和耐盐性，可以更好的应用于胞苷二磷酸胆碱的制备上。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种嗜盐胆碱激酶突变体及其应用。

背景技术

在胞苷二磷酸胆碱的生产过程中，随着反应进行盐浓度逐渐升高，当盐浓度超过1200mM时，胆碱激酶CKI(NP_013234.1)活性降低了75％～80％(刘毅，王杰等.ATP供体模块驱动的高效多酶催化CDP胆碱生产[J]，2017)。为了适应反应的盐环境，我们需要寻找一种高效耐盐的胆碱激酶。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明基于酿酒酵母S288C的CKI基因，构建一种改造的嗜盐胆碱激酶，这种酶可以应用于高盐环境下胞苷二磷酸胆碱的生成。

为实现上述目的，本发明在序列为SEQ ID NO:1的胆碱激酶的基础上，进行定点突变，所述突变为如下突变中的至少一种：

(1)将第46位氨基酸异亮氨酸突变成氨基酸谷氨酸；

(2)将第59位氨基酸亮氨酸突变成氨基酸天冬氨酸；

(3)将第77位氨基酸丙氨酸突变成氨基酸天冬氨酸；

(4)将第344位氨基酸天冬酰胺突变成氨基酸谷氨酸；

(5)将第346位氨基酸脯氨酸突变成氨基酸谷氨酸；

(6)将第347位氨基酸丝氨酸突变成氨基酸天冬氨酸；

(7)将第509位氨基酸赖氨酸突变造成氨基酸天冬氨酸；

(8)将第558位氨基酸异亮氨酸突变成氨基酸谷氨酸。

在一种优选地实施方式中，本发明提供了一种嗜盐胆碱激酶突变体M1，所述突变体由序列为SEQ ID NO:1的胆碱激酶突变而来，所述突变为上述突变中的(1)、(3)和(5)，即：I46E，A77D和P346E。所述嗜盐胆碱激酶突变体M1的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

在另一种优选地实施方式中，本发明提供了一种嗜盐胆碱激酶突变体M2，所述突变体由序列为SEQ ID NO:1的胆碱激酶突变而来，所述突变包括(1)、(3)、(4)、(5)和(7)，即：I46E，A77D，N344E，P346E，K509D。所述嗜盐胆碱激酶突变体M2的氨基酸序列为SEQ IDNO:3。

在又一种优选地实施方式中，本发明提供了一种嗜盐胆碱激酶突变体M3，所述突变体由序列为SEQ ID NO:1的胆碱激酶突变而来，所述突变包括(1)-(8)，即：I46E、L59D、A77D、N344E、P346E、S347D、K509D和I558E。所述嗜盐胆碱激酶突变体M3的氨基酸序列为SEQID NO:4。

编码上述嗜盐胆碱激酶突变体的核苷酸序列也在本发明的保护范围之内。

具体地，编码SEQ ID NO.2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码SEQ ID NO.3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；编码SEQ ID NO.4的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

进一步地，本发明提出了包含上述编码嗜盐胆碱激酶突变体的核苷酸序列的表达载体，优选地，所述表达载体为pET-28a。

更进一步地，本发明提出了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述表达载体。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明进一步提出了上述嗜盐胆碱激酶突变体M1-M3在制备胞苷二磷酸胆碱上上的应用。