[发明专利]SOD3在调控双氢青蒿素诱导的脾脏增大及免疫细胞异质性药物筛选或疫苗评价中的应用

权利要求书

1.SOD3在调控双氢青蒿素诱导的脾脏增大及免疫细胞异质性药物筛选或疫苗评价中的应用。

2.根据权利要求1所述的SOD3在调控双氢青蒿素诱导的脾脏增大及免疫细胞异质性药物筛选或疫苗评价中的应用，其特征在于所述的双氢青蒿素在调控脾脏增大及免疫细胞异质性的检测方法，包括如下步骤：

步骤1，将0.1 g羧甲基纤维素钠（CMC-Na）加入到20 mL加热至100℃的蒸馏水中，在磁力搅拌器中搅拌3-5 h，当温度恢复至室温时，加入0.2 g 双氢青蒿素（DHA），4℃避光连续搅拌10-12h，得到双氢青蒿素溶液；

步骤2，给小鼠连续灌胃100mg/kg/d双氢青蒿素溶液26天后，取小鼠脾脏；

步骤3，将小鼠脾脏置于70 μm的细胞筛上，细胞筛下面放置一个50 mL的离心管，用注射器尾部带棱面研磨，同时加入预冷PBS冲洗，收集细胞悬液于15 mL的离心管中；

步骤4，上述步骤3中的细胞悬液1500 rpm/min离心5 min，吸去上清，留沉淀，用红细胞裂解液裂解红细胞，混匀后冰上静止3 min；

步骤5，上述步骤4中裂解红细胞后的细胞悬液1500 rpm/min离心5 min，吸去上清，留沉淀，加入预冷5 mL PBS重悬，洗涤3遍，从而制备双氢青蒿素诱导的免疫细胞亚群悬浊液；

步骤6，使用荧光显微镜及血球计数板计算小鼠脾脏免疫细胞数量；

步骤7，使用流式细胞术及单细胞转录组测序方法测定双氢青蒿素诱导的免疫细胞亚群的异质性。

3.根据权利要求2所述的SOD3在调控双氢青蒿素诱导的脾脏增大及免疫细胞异质性药物筛选或疫苗评价中的应用，其特征在于所述的小鼠选体重18-20g的健康雌性BALB/c小鼠，所有小鼠均饲养于无特定微生物的小动物房中，保持黑暗12小时和光照12小时。

4.根据权利要求2所述的SOD3在调控双氢青蒿素诱导的脾脏增大及免疫细胞异质性药物筛选或疫苗评价中的应用，其特征在于所述的步骤4中，红细胞裂解液为155 mM NH 4Cl，10 mM KHCO3，0.11 mM EDTA.Na2，pH 7.2。

5.根据权利要求2所述的SOD3在调控双氢青蒿素诱导的脾脏增大及免疫细胞异质性药物筛选或疫苗评价中的应用，其特征在于所述的步骤7中，使用流式细胞术测定双氢青蒿素溶液诱导的免疫细胞亚群的方法，包括下述步骤：

（1）将所获得的脾脏单细胞悬浮在含有 0.04% BSA 的 PBS 中；

（2）制备不同组合的流式抗体组合，流式抗体组合如下：

第一组抗体，7AAD、抗CD45-pacific blue抗体、抗CD3-PE抗体、抗CD4-APC/Fire™750抗体、抗CD8a -FITC抗体、抗CD19-BV510抗体、抗 CD45R/B220-APC抗体；

第二组抗体，7AAD、抗CD45-pacific blue抗体、抗CD11b-APC抗体、抗 Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)-FITC抗体;

（3）将待测样本分别加入到流式管A和B中，使呈单个细胞悬液状态，并保证细胞量1×10 6/管-1×10 7/管；所述待测样本为脾脏；

（4）向步骤（3）处理得到的流式管A中加入本发明所述的试剂组合物中的第一组抗体，向步骤（3）处理得到的流式管B中加入本发明所述的试剂组合物中的第二组抗体，各流式管4度条件下避光孵育30分钟；

（5）孵育结束后，向步骤（4）每管加入700 μL PBS，混匀，1500 rpm/min离心5 min，洗涤2次，吸去上清，留沉淀；

（6）向步骤（5）去上清后的流式管中，分别加入PBS缓冲液洗涤，离心后去上清，用PBS缓冲液重悬细胞，即得到流式细胞上机样品。

6.根据权利要求2所述的SOD3在调控双氢青蒿素诱导的脾脏增大及免疫细胞异质性药物筛选或疫苗评价中的应用，其特征在于所述的步骤7中，使用单细胞方法测定双氢青蒿素诱导的免疫细胞亚群的方法，包括细胞捕获和 cDNA 合成，具体步骤如下：

（1）将所获得的脾脏单细胞悬浮在含有 0.04% BSA 的 PBS 中；

（2）在芯片的每个通道加入约6,000个细胞，预计回收的目标细胞约为3,000个细胞；

（3）捕获的细胞被裂解，释放的 RNA 在单个 GEM 中通过逆转录进行条形码标记;

（4）逆转录在 S1000TM Touch Thermal Cycler (Bio Rad) 上在 53°C 下进行 45 分钟，然后在 85°C，5 分钟，在结束后保持在 4°C；

生成的cDNA在安捷伦4200分光光度计中确定质量。