[发明专利]一种抗肿瘤多肽的制备方法及应用

权利要求书

1.一种抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：收集成熟的杭白芷，去除杂质，低温压榨脱油后将杭白芷捣碎，并用粉碎机粉碎后过40目筛子，得脱脂杭白芷粉末，用蒸馏水将脱脂杭白芷粉末浸泡溶胀，调节料液比和pH值，在超声波作用下使脱脂杭白芷粉末中的蛋白质充分溶解，离心收集沉淀，经冷冻干燥后得杭白芷分离蛋白；

S2：取金藿斛粉末，用液氮研磨后加入PBS浸泡12-36h，用纱布过滤掉残渣得到金藿斛的PBS提取液；在PBS提取液中加入硫酸铵过夜，离心后除去上清液，得到蛋白浸膏，用PBS溶解蛋白浸膏后装入透析袋，透析一定时间，然后冻干得到金藿斛蛋白质粉末；

S3：取杭白芷分离蛋白和金藿斛蛋白质粉末,蒸馏水配成蛋白液，分别加入碱性蛋白酶Alcalase、碱性蛋白酶37017和胰蛋白酶进行水解，水解后，灭酶、冷却至室温、离心取上清液，可得三种酶解液；

S4：用装有截留分子量为3kDa超滤膜的AmiconUltra-15离心超滤管对三种酶解液产物进行分离，离心分离后，收集超滤液；

S5：采用Biotage快速制备液相色谱全自动纯化系统对超滤液分离纯化，色谱柱为SephadexG-15，洗脱液为0.1mol/L的NaCl，流速1mL/min，检测波长280nm，三种酶解产物经Sephedax G-25色谱柱层析后共得到9个多肽组分，即得抗肿瘤多肽。

2.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于：所述S1中离心转速为5000-10000r/min。

3.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于：所述S2中透析袋的截留分子量范围为5000-10000，透析时间为2-4天。

4.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于：所述S3中的水解过程中实时用0.05-0.5mol/L的NaOH和HCL来调节反应体系的pH值，控制pH值在pH±0.05之内；其中

所述碱性蛋白酶Alcalase 2.4L的酶解条件为：底物质量浓度30g/L，pH9.5，酶解温度60℃；

所述胰蛋白酶的酶解条件为：温度25-55℃，pH＝6-10，反应时间为6-12h；

所述碱性蛋白酶37017的酶解条件为：酶温度20-65℃，pH＝7-10，反应时间为6-13h。

5.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于：所述S3中的灭酶为在90-100℃的水浴中灭酶10-30min；所述S3中的离心为5000-10000r/min下离心5-30min。

6.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于：所述S4中离心转速为8000rpm，离心时间25min。

7.一种如权利要求1所述的抗肿瘤多肽的应用，其特征在于：所述抗肿瘤多肽在抗肝癌药物中的应用，用于抑制人肝癌细胞HepG2的增殖。