[发明专利]一种RcFAH12基因启动子和其缺失突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种2605bp长的RcFAH12启动子及其缺失突变片段，所述RcFAH12启动子及缺失突变片段的获得方法包括以下步骤：将全基因合成的RcFAH12启动子‑2506～+99bp序列，连入pUC57质粒载体中得到质粒pUC57‑RcFAHP2605，并以质粒pUC57‑RcFAHP2605为模板，分别以对应的T/B引物对进行PCR扩增，得到10个启动子缺失突变片段，经PCR扩增、纯化、连接，成功构建含不同RcFAH12基因启动子缺失克隆的表达载体，并通过拟南芥遗传转化，利用农杆菌介导的蘸花法侵染拟南芥，得到T3代转基因拟南芥，对T3代转基因拟南芥组织进行GUS染色分析，得出不同长度的RcFAH12基因启动子表现出不同的启动表达活性，包括具有组成型启动表达、种子相对特异性表达、花粉特异性表达，在植物基因工程育种中具有重要应用价值。

技术领域

本发明属于植物生物工程育种和分子生物学技术领域，具体涉及一种RcFAH12基因启动子和其缺失突变体及其应用。

背景技术

蓖麻(Ricinus communis L.)是一种大戟科二倍体(x＝10，2n＝20)油料植物，其种子中含有39.6％～59.5％的甘油三酯，其中一种特殊的羟化脂肪酸——蓖麻醇酸酯(Ricinoleate)，也称蓖麻油酸(18:1-OH；12-hydroxy-9-cis-octadecenoic acid)约占总脂肪酸的81.44％～90.25％，其比例与种子发育时间正相关。催化蓖麻油酸生物合成的关键酶是油酸-12-羟化酶(oleate 12-hydroxylase,RcFAH12)，属于脂肪酸修饰酶，能将磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)的Sn-2-油酰基转变为Sn-2-蓖麻油酰基。是蓖麻油中产生高蓖麻油酸的重要原因。

基因启动子的研究对于理解基因表达调控至关重要，分离的启动子序列及其元件对基因的精细调节也至关重要。不同的启动子使基因具有不同的表达特性。选择合适的启动子对于外源基因的表达量至关重要。能够使基因在大多数的细胞类型中表达的启动子称为组成型启动子，如对许多双子叶植物转基因工作而言，最常用的一种启动子是来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子。它们是植物基因工程中应用最早、最广泛的一类启动子，特点是表达具有持续性，表达量基本恒定，也正由于这种特点使得外源基因产物可能对植物的生长发育产生不利影响，甚至导致死亡。此外，重复使用同一种启动子驱动两个或两个以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制现象。为了使外源基因在植物体内高效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，使人们越发注重特异表达启动子和诱导型启动子的研究和应用，使启动子在特定的组织和一定的发育时期启动基因表达，使基因表达能够对特异条件产生响应，既保证了外源基因在植物体内的有效发挥又减少了对植物的不良影响。目前，大量的特异性启动子和诱导型启动子已被克隆和功能分析，并已广泛应用于植物基因工程中。

发明内容

本发明利用RACE技术，确定RcFAH12基因转录起点位置，得到启动子及其缺失片段，并进一步的将缺失片段转化到拟南芥中，得到该基因缺失片段启动基因表达的模式，提供了一种来源于蓖麻的RcFAH12基因启动子和其缺失突变片段及应用。

一种RcFAH12启动子，所述RcFAH12启动子是利用RACE技术确定RcFAH12转录起始位点，参照蓖麻基因组序列合成的RcFAH12启动子-2506～+99bp序列。本发明还公开了一种RcFAH12启动子的缺失突变片段，所述RcFAH12启动子及缺失突变片段的获得方法包括以下步骤：将RcFAH12启动子-2506～+99bp序列，连入pUC57质粒载体中得到质粒pUC57-RcFAHP2605，并以质粒pUC57-RcFAHP2605为模板，分别以对应的T/B引物对进行PCR扩增，得到10个启动子缺失突变片段。