[发明专利]一种基于RAA-CRISPR检测SARS-CoV-2 69-70del位点的方法

说明书

本发明公开了一种用于检测SARS‑CoV‑2 69‑70del位点的CRISPR‑Cas13a系统。该系统包括RT‑RAA扩增引物、Cas13a蛋白和crRNA；RT‑RAA引物对由SEQ ID NO:7所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:8所示的单链DNA分子组成；SARS‑CoV‑2 69‑70del位点的靶点序列位于SARS‑CoV‑2基因组第21753‑21786位，并缺失tacatg 6个碱基；SARS‑CoV‑2 69‑70del位点的crRNA序列如SEQ ID NO:3所示。实验证明，本发明可实现对SARS‑CoV‑2 69‑70del位点核酸的高灵敏、高特异检测，灵敏度达到单拷贝。本发明具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种基于RAA-CRISPR检测SARS-CoV-269-70del位点的方法。

背景技术

COVID-19是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)所引起的疾病。随着时间的推移，SARS-CoV-2出现了多种新的值得关注的变异株(VOCs)。B.1.1.7谱系(VOC202012/01，501Y.V1)首先出现在英格兰南部，这个谱系的特征在于17个突变，包括14个氨基酸替换和3个位于ORF 1a/b，ORF8，Spike(S)和N基因区域2的框架内缺失。而位于S基因区中的69-70del已被证明具有潜在的生物学意义。69-70del是SARS-CoV-2刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)n端结构域(ntd)中的第69位的组氨酸(h69)和第70位的缬氨酸(v70)缺失突变，69-70del可引起S蛋白S1亚基构象改变。目前已有研究表明，69-70del主要与造成免疫逃逸的突变位点同时出现，增强病毒的细胞感染力。此外，基于目前的监测数据69-70del还常与位于S蛋白的N501Y、N439K以及Y453F突变同时出现。已有研究证明，利用假病毒模拟B.1.1.7变异株S蛋白的氨基酸突变，69-70del的B.1.1.7病毒变异株对细胞的感染力显著增强。研究显示，69-70del增强病毒感染力的机制可能是通过增加病毒粒子表面S蛋白密度来实现的。目前，对SARS-CoV-2变异株的检测方法主要有两种：一种是基因测序技术，包括Sanger测序和二代测序；另一种是基于逆转录荧光定量PCR(RT-qPCR)的核酸检测技术。尽管这两种技术在鉴别新发变异中发挥着至关重要的作用，但均依赖专业的仪器设备、实验室设施和检测人员，在基层医疗卫生机构、偏远地区以及南非、印度等发展中国家及地区难以实现快速现场检测。为提升基层一线和欠发达地区的变异株检测能力，推动检测技术的前移下移，迫切需要开发一种快速、便捷、灵敏、特异的新冠病毒变异位点检测方法。

2017年4月，美国研究人员建立了一种灵敏度达到埃摩级(单拷贝)、特异性达到单碱基的核酸检测技术—基于CRISPR-Cas13a的核酸检测平台SHERLOCK(Specific HighSensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)，利用Leptotrichia wadei Cas13a蛋白(LwCas13a)的非特异剪切活性，结合可以高效扩增目的片段的重组聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，实现了对痕量核酸快速、廉价、高灵敏的检测。研究表明，Cas13a可用于生物样本(血液或尿液)中寨卡以及登革热病毒的鉴定，并进一步区分非洲毒株和美洲毒株的基因序列，还可用于鉴定细菌的特定类型。而其在鉴定病毒或细菌核酸之后，通过设计特异的crRNA可以直接用于病原体的分型，其超高的灵敏度避免了大量复杂的上游实验工作，即可直接扩增生物样本进行检测，缩短了样品的前处理过程。由此可见，该技术在基础研究、诊断和治疗领域的巨大应用前景。

发明内容