[发明专利]罗汉果来源糖基转移酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了罗汉果来源糖基转移酶突变体，其氨基酸序列具有所述发生突变的SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性、具有糖基转移酶活性的功能性片段。可以有效催化黄酮类糖基化反应，相比于野生型糖基转移酶突变体酶具有较好的区域选择性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及具有不同区域选择性的罗汉果来源糖基转移酶突变体及其应用。

背景技术

天然产物糖基化修饰是植物活性物质合成关键步骤。在天然产物糖基化过程中，由于糖基转移酶所能催化的潜在糖基化位点多样，导致多种糖基化产物的生成，降低了目标糖苷的转化率。利用蛋白质工程、定点突变的方法对糖基转移酶进行改造，得到具有良好的糖基化修饰功能、并能够用于合成目标产物的糖基转移酶突变体对于重要天然化合物的合成与应用具有重要的意义。

发明人从罗汉果中预测并实验验证了罗汉果来源的糖基转移酶UGT74AC2在黄酮类(水飞蓟宾、山奈酚、白杨素、橙皮素、黄豆苷元、毛蕊异黄酮、鹰嘴豆芽素等)以及含氮或含硫等化合物(4-氨基二苯甲酮、3-氨基二苯甲酮、3,4二氯苯胺、3,4二氯苯硫酚和2,6二氯苯硫酚)中的催化功能，但其专一性催化不理想。

发明内容

本发明提供具有不同区域选择性的糖基转移酶突变体，可以有效催化黄酮类糖基化反应，相比于野生型糖基转移酶突变体酶具有较好的区域选择性。

本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种糖基转移酶突变体，所述糖基转移酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列，优选具有90％以上、95％以上或98％以上的同源性。

其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中至少在G11、P12、F88、M119、Y145、T149、L200、V190和Y392位的氨基酸中的至少一个氨基酸残基发生突变。作为本发明的一个实施方式，突变是指序列中原氨基酸被1个或多个的其他氨基酸残基取代。

其他氨基酸残基为丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中之一。

所述糖基转移酶突变体包括对应于SEQ ID NO:1，发生如下位点的取代：G11Y、Y145F、P12Y、P12G、F88S、M119L、M196L、M119W、L200W、L200F、L200Y、L200M、Y145W、Y392T、V190I、V190W中的任一种或二种以上的组合。优选组合突变包括：V190I/M119Q、V190I/L200M、V190I/Y392S、G11Y/Y145F、P12Y/L200W、Y392T/L43A、Y392T/F88M、Y392T/T149V、Y392T/M196N、Y392T/L200M、Y392T/K287Y。

在一个实施方案中，所述糖基转移酶突变体同时包括对应于SEQ ID NO:1的第11位甘氨酸和第145位酪氨酸的突变，例如位于第11位甘氨酸G突变为酪氨酸Y，同时第145位酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F，该突变体能够对水飞蓟宾的C3位羟基和C7位羟基同时进行糖基化修饰形成双糖基化产物，并且双糖基化产物的比例能够达到99％以上。

在一个实施方案中，所述糖基转移酶突变体至少包括对应于SEQ ID NO:1的第12位脯氨酸P突变为酪氨酸、第200位亮氨酸L突变为苯丙氨酸F或色氨酸W或第145位酪氨酸Y突变为色氨酸W；优选，所述糖基转移酶突变体包括如下位点的突变：P12Y和L200W，该突变体能够对水飞蓟宾的C7位羟基进行选择性糖基化，且选择性能达到99％以上。