[发明专利]壳寡糖与二价植物疫苗共价偶联体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种壳寡糖(COS)与二价植物疫苗HrpN189‑NAC共价偶联体的制备方法和应用。具体涉及采用微生物来源转谷氨酰胺酶将壳寡糖(1.5KDMW2.5KD)与二价植物疫苗在温和条件下进行催化，获得共价偶联体(COS)_n‑HrpN189‑NAC，接枝度范围为45‑60％。实验表明，(COS)_n‑HrpN189‑NAC能显著促进植物的种子发芽、生长和果实产量提升，且能够强烈激发烟草的免疫反应，以及抑制番茄丁香假单胞菌和灰霉病菌等病原菌，因而可以广泛应用于植物促生长和抗病虫害领域。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酶催化壳寡糖共价偶联二价植物疫苗的制备方法和应用。

背景技术

壳寡糖(Chitosan oligosaccharide，COS)是自然界中唯一带正电碱性氨基低聚糖，是将壳聚糖经特殊的生物酶技术(也有使用化学降解、微波降解技术的报道)降解得到的一种聚合度在2-20之间寡糖产品，分子量≤3200Da，因含有-NH₂、-OH以及少量的N-乙酰氨基，具有配位螯合功能，可以对其进行交联、酰化、接枝、磺化、羧甲基化、络合等多种化学改性和修饰反应。壳寡糖可广泛地应用于农业领域，可以改变土壤菌群，促进有益微生物的生长，可诱导植物的抗病性，可引起植物产生对多种真菌、细菌和病毒免疫和杀灭作用。研究表明，壳寡糖对小麦花叶病、棉花黄萎病、水稻稻瘟病、番茄晚疫病等病害具有良好的防治作用，可以开发为生物农药、生长调节剂和肥料等。其主要通过能激发植物抗性相关基因表达，如几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶和苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因表达量增加，且提升植物体内信号分子NO的含量。

二价植物疫苗HrpN189-NAC是采用基因重组技术构建而成(专利号：201911335390.7)。此蛋白是HrpN蛋白N端的1-189个氨基酸HrpN189和新生多肽相关复合体α亚基NAC通过柔性链接(G₄S)₃的融合体，设计的原理是基于HrpN189和NAC可以同时与相同细胞上但不同的受体结合，从而增加蛋白与受体结合效率，提高植物诱导抗性。结果表明，与单价HrpN和NAC相比，HrpN189-NAC不仅具有HrpN和NAC两种蛋白的功能，且能高效激活植物体内水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ETH)途径，快速激活植物抗病、抗虫、抗逆性、并可调节植物的生长发育。研究证明，HrpN189-NAC适用的植物种类更多，激发烟叶产生超敏反应活性明显高于HrpN和NAC，且蛋白稳定性极高，煮沸60分钟，活性无明显变化。再者，二价融合免疫蛋白HrpN189-NAC能显著促进小麦种子的发芽，24h后发芽率达到90％。在增强植物免疫抵抗力方面，HrpN189-NAC对水稻灰霉病、烟草花叶病、小麦白粉病和辣椒青枯病等的防治效果达到70％以上。

转谷氨酰胺酶(Transglutaminase，TGase)是一种催化转酰基反应的酶，能催化蛋白质或多肽中的谷氨酰胺残基的γ-羟胺基团(酰基供体)与各种伯胺类化合物(酰基受体)之间的酰基转移反应，相对分子质量为38kDa。不同来源的转谷氨酰胺酶的活性对金属离子的依赖性不同，例如动物性酶依赖于Ca²⁺，而微生物酶对Ca²⁺无依赖性。大多数金属离子对微生物转谷氨酰胺酶的活性无影响或影响不大，但Zn²⁺对其有较强抑制作用。

然而，壳寡糖和植物疫苗需经过与受体结合诱导抗性基因表达后才能产生抗病性，且抗病性的强弱取决于其与受体的结合接触机率、受体结合效率、抗性基因表达的程度和环境条件等影响，因而不能高效有效控制病害的发生。且植物疫苗由于自身的稳定性，很容易被环境微生物降解，造成资源浪费和活性的降低。因此，亟需开发高效稳定植物免疫激发剂，满足现在绿色农业对产品的要求。

发明内容