[发明专利]鼠源肠道α-防御素及其应用

说明书

本发明公开了一种鼠源肠道α‑防御素及其应用，属于生物技术领域。该鼠源肠道α‑防御素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明构建了小鼠α‑防御素亚型Defa20的重组表达载体，并转入HEK293细胞中进行真核细胞表达，优化了真核表达及后续纯化的方法，提高了表达效率和蛋白纯度，纯化后的蛋白具备明显的体外抑菌效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鼠源肠道α-防御素及其应用。

背景技术

抗菌肽（Antimicrobial peptide）是一类天然存在于几乎所有生命体的小分子多肽，不仅具有广谱的抗菌活性，对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞均有强有力的杀伤作用，同时也是机体天然免疫的重要组成部分。α-防御素是抗菌肽家族重要组成成员，在肠道中由潘氏细胞表达并分泌，不仅参与宿主的免疫防御，而且能够调节肠内菌群的组成，对于维持肠道平衡，保持肠道健康非常重要。α-防御素的两亲性结构利于其嵌入细胞膜，其二聚体或者多聚体形成跨膜离子通道，造成细胞膜像孔一样的缺陷，膜的通透性发生改变，使必要的离子和营养物质等内容物外渗，细菌裂解死亡。与传统抗生素不同的是，防御素是机体自身产生的生物活性分子，不易引起细菌病原体产生耐药性，同时对机体共生菌具有兼容调节作用。防御素在抑制病原微生物方面的特性使其有望成为传统杀菌剂和抗生素的替代物，在医疗工业和食品添加剂行业具有很好的应用前景。

虽然防御素具有广阔的应用前景和巨大的开发潜力，但是其产业化进程和机制理化研究比较缓慢。防御素的生产方式主要有三种：天然提取法，化学合成法以及基因工程法。天然防御素在动物体内含量低，从动物体内提取防御素存在产量低、费事长、工艺复杂、效价低、价格昂贵等不足。化学合成防御素多肽存在成本高，难度大，且不能控制多肽的二硫键和空间折叠构象，影响其活性。因此，开发和制备能够克服上述缺点的新一代防御素具有重要意义。目前通过微生物发酵、细胞表达纯化等基因工程方法，可规模化大量表达有活性的防御素，是目前生产防御素多肽的最佳途径。基因工程可分为原核细菌表达和真核细胞表达，原核细胞表达可以大量产生多肽，缺点是多肽可能缺乏翻译后修饰，影响多肽功能。而真核细胞表达产生的多肽则避免了这一问题，得到类似于机体天然产生的活性防御素。

发明内容

本发明的目的是提供鼠源肠道α-防御素蛋白及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

鼠源肠道α-防御素蛋白，其氨基酸序列为：

SRDLICYCRKGGCNRGEQVYGTCSGRLLFCCRRRHRH（SEQ ID No.1）。

编码SEQ ID No .1所示蛋白的核酸，其核苷酸序列为：

GAAGAGCAGCCGGGACCTGATCTGCTACTGCAGAAAGGGCGGATGTAATAGAGGCGAGCAAGTGTACGGCACCTGTAGCGGCAGACTGCTCTTCTGCTGCCGGAGACGGCACAGACACCACCACCACCATCACCACTGA（SEQID No.2）。

一种重组载体，它包含SEQ ID No.2所示的核酸。优选地，所述重组载体为pCDNA3.4。

SEQ ID No.1所示的蛋白或编码SEQ ID No.1所示蛋白的核酸或上述的重组载体在制备抗菌产品中的应用。优选地，所述抗菌产品可抑制革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌的生长。

SEQ ID No.1所示的蛋白通过以下步骤制备得到：

步骤1，优化表达该防御素的基因序列；

步骤2，构建上述防御素的表达载体；

步骤3，将上述表达载体转化入原核表达宿主中；

步骤4，扩增质粒，转染至HEK293细胞中表达该防御素；

步骤5，纯化上述表达的防御素重组蛋白。