[发明专利]鞭毛素突变体与非洲猪瘟抗原的融合蛋白及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了了鞭毛素突变体与非洲猪瘟抗原的融合蛋白及其应用。本发明将非洲猪瘟保护性抗原与鞭毛素突变体融合，能够大量表达和制备。虽然p22、p62抗原的自身免疫原性具有差异，但是融合鞭毛素后，均可以显著提高抗原p22、p62的黏膜免疫水平，同时由于所构建的鞭毛素突变体能够在上清中高效表达，融合后有助于p22、p62的上清表达。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及鞭毛素突变体与非洲猪瘟抗原的融合蛋白及其应用。

背景技术

通过鞭毛素蛋白与目的蛋白混合或融合后免疫，可以提高机体对抗原的免疫应答，其中鞭毛素融合或偶联抗原免疫效果更为显著【1】【2】，以鞭毛素为佐剂的核酸疫苗仅在实验室阶段研究，虽然不用经过蛋白纯化工艺，但是核酸疫苗本身面临着不可预知的安全风险和临床监管；目前很多致病菌的鞭毛素可能具有潜在的危险性和毒性，免疫动物后产生大量针对自身的抗体，导致可能的耐受性及炎症反应，这主要源于鞭毛素可变区的高免疫原性。沙门氏同种属的鞭毛素蛋白的氨基及羧基末端比较保守，从结构上可以分为保守的D0，D1,可变区D2和D3区；其中鞭毛素蛋白抗原性很强的区域位于D2和D3区，根据文献报道，外源抗原通常可以与鞭毛素羧基端连接或插入高可变区(I型鞭毛素174-400位或201-368位)，均保留了鞭毛素TLR5信号通路活性【3、4】。保守D0结构域由N端和C端两组α螺旋构成，C末端6个氨基酸VLSLLR形成疏水基序Motif，位于鞭毛素内核，亚基间的强疏水相互作用是参与鞭毛素组装的关键驱动力【5、6】。

近年来非洲猪瘟在国内外集约化养猪场的感染率和发病率日益提高，给养殖场带来巨大的经济损失。非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswine fever virus，ASFV)引起的以高热、皮肤发绀、淋巴及内脏器官严重出血为特征的急性、接触性传染病，一旦暴发，死亡率接近90-100％。家猪和野猪是该病毒的自然宿主，感染后可终身带毒。ASFV是一种单股、两端共价连接的双链DNA病毒，具有二十面体结构，基因组全长约170kb～190kb，主要由4层组成：中央核仁、核衣壳、内层囊膜和二十面体的病毒衣壳，胞外病毒粒子，核衣壳具有双层囊膜。

研究表明，非洲猪瘟p22和p62等结构蛋白在病毒入侵，衣壳组装上起到重要作用【7,8,9】以这些蛋白为靶标的核酸疫苗及活载体疫苗均能一定程度上抑制非洲猪瘟在肺泡巨噬细胞(PAM)上的复制和增殖，降低带毒量，延缓病情的发作。非洲猪瘟病毒的传播途径粪口传播，在唾液和扁导体的分离率很高。因此，提高粘膜免疫对于非洲猪瘟的防控具有积极意义。

因此本发明从发现最小的肠道沙门氏鞭毛素(WP_050188722)进行设计突变，与非洲猪瘟抗原融合表达，以期提高猪群对靶抗原的黏膜免疫效果。

发明内容

本发明的目的是提供鞭毛素突变体与非洲猪瘟抗原的融合蛋白，所述的融合蛋白是将鞭毛素突变体于非洲猪瘟P22或P62蛋白进行融合，制备的融合蛋白Fm-p22的氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示，Fm-p62的氨基酸序列为SEQ ID NO.13所示。

本发明的另一个目的在于提供鞭毛素突变体与非洲猪瘟抗原的融合蛋白在制备疫苗非洲猪瘟疫苗中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：