[发明专利]一种基于3D打印用于髋臼骨缺损重建的方法

权利要求书

1.一种基于3D打印用于髋臼骨缺损重建的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的制备、表征以及细胞相容性检测；

A1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的制备：

工程师在UG软件中分别绘制出直径为1.5cm高度为0.5cm以及直径为0.4cm高度为0.15cm的圆柱形人工垫块的三维数字模型图，并将数据以STL格式保存并导入3D打印主程序中进行分层切片处理，再将获得的各断层数据导入EBM设备，进行产品的打印制作；

在粉仓内装入钛合金(Ti6Al4V)粉末，由粉耙均匀铺设在工作平台上，厚度为0.5～1mm；关闭舱门，工作舱抽至真空，真空度需达到10-4～10-5mbar；电子束枪在电脑程序控制下发射高能电子束并聚焦至工作平台，受到高能电子束照射的钛金属粉末颗粒瞬间被加热熔融再经冷却凝固，通过分层加工、叠加成型的方式打印出所需要的金属定制物；去除未熔融的金属粉末，并经后续的抛光加工等处理即可获得最终的个性化金属垫块成品，经消毒后无菌存放备用；

B1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的孔隙率检测；

孔隙率的测定：采用排液法测定孔隙率；取直径为1.5cm高度为0.5cm圆柱形3D打印人工垫块及传统成品人工垫块，将其浸没在已知体积(V1)的无水乙醇中，减压使乙醇充满支架内部所有孔隙，总计体积为V2；一段时间后，轻轻取出支架，剩余乙醇体积标记为V3；孔隙率由公式(a)得到；

Porosity＝(V1–V3)/(V2–V3) (a)

C1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的表面结构观察；

形貌及结构：分别将3D打印人工垫块及传统成品人工垫块在20mA条件下喷金2min制备样品，用扫面电镜观察其表面结构以及孔隙大小等；

D1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的抗压强度测试；

分别取直径为1.5cm高度为0.5cm圆柱形3D打印人工垫块及传统成品人工垫块各6个式样，在37℃、100％相对湿度环境中养护72小时，上下表面打磨平整，置于万能试验机上进行压缩测试；加载速率为1mm/min，记录载荷-位移曲线；按照以下公式(b)计算得出式样的抗压强度值：

P＝4NπD2 (b)

式中P代表式样的抗压强度，N代表载荷峰值，D代表式样的直径；

S2、电子束熔融3D打印的钛金属植入物生物学特性的体外表征；

A2、成骨细胞的培养；

将MC3T3-E1细胞系用0.25％Trypsin-EDTA消化、计数，取1×107个细胞，接种于直径为75cm2的细胞培养皿中，于37℃、5％CO2条件下培养，每皿加入8～10mL培养基，隔天换液；待细胞90％融合后，用0.25％Trypsin-EDTA消化传代；

B2、细胞在材料表面黏附增殖的形态学检测；

将直径为1.5cm高度为0.5cm圆柱形3D打印人工垫块及传统成品人工垫块进行辐照灭菌以用于生物学试验；两种垫块各取30个置入24孔板中，一个垫块对应一孔，加入细胞培养基于37℃、5％CO2条件下浸泡3天后，每孔植入1×105个MC3T3-E1细胞，另取15孔无材料孔亦植入1×105个MC3T3-E1细胞作为空白对照；

分别于第1、3、7、14、21天从各组各取3孔吸去培养基并用PBS溶液清洗后，加入4％多聚甲醛固定10分钟；随后用2％BSA溶液封闭2小时，封闭结束后于避光环境下依次加入工作浓度为5μg/mL的FITC-鬼笔环肽溶液和DAPI溶液，各反应20分钟，反应结束后均吸除反应溶液并用PBS溶液清洗；将染色后的样品置于荧光显微镜下观察各组材料表面细胞形态、数量以及孔隙内细胞长入情况，并与空白对照组细胞形态相对比；

另对各时间点的各组细胞-垫块复合物行SEM检测；第1、3、7、14、21天时于3D打印人工垫块组及传统成品人工垫块组各取出3个样品以PBS洗净，并以1％锇酸于4℃固定4小时，随后采用酒精梯度脱水，各浓度脱水时间不小于20分钟；完成脱水后空气干燥，并抽真空、喷金，采用SEM观察垫块表面细胞的数量、数量以及孔隙内细胞长入情况；

C2、垫块生物相容性的定量检测；

将直径为0.4cm高度为0.15cm3D打印人工垫块及传统成品人工垫块置于96孔板中，另设无材料对照组，于各孔中植入1×104个MC3T3-E1细胞进行培养，取第1、3、7、14、21天作为观察点行MTS法检测分析；于各时间点各组取3孔，吸尽孔内的培养基，并用PBS溶液清洗后再于各孔内加入100mL细胞完全培养基及20μL、1.90mg/mL的MTS溶液，并于细胞培养箱内孵育3小时后从各孔内吸出100μL于新孔中，运用紫外分光光度仪检测490nm波长处的OD值，记录结果，绘制各组细胞生长曲线；

S3、电子束熔融3D打印的钛金属植入物生物学特性的体内表征；

A3、山羊股骨缺损模型的建立及材料植入术前先采用电子束熔融3D打印技术制备φ1cm×1cm/φ3cm×3cm/φ5cm×5cm的钛金属垫块，辐照灭菌消毒后无菌存放备用；

选取重20～25kG青山羊；提前送至动物中心分笼饲养一周以适应环境；试验开始前肌注速眠新(0.15mL/kG)麻醉成功后,将山羊右侧卧位固定于实验台上，后肢备皮,用2.5％碘酒、75％酒精棉球消毒、铺巾；取股骨外侧下端纵向切口长约5cm，依次切开皮肤、皮下组织、阔筋膜，显露外侧股骨髁，采用电钻钻取出φ1cm×1cm/φ3cm×3cm/φ5cm×5cm缺损；并将各组无菌保存的材料置入缺损部位；其中，传统成品人工垫块组以运用各种大小的成品垫块尽可能填满缺损为宜；假手术组中，只行皮肤及肌肉的切开与缝合，不行股骨髁钻孔及样品置入；随后，采用生理盐水冲洗伤口，逐层缝合，无菌敷料包扎，不作外固定，自由活动；术前、中及术后3天肌注青霉素8万单位，链霉素0.5g；高蛋白青饲料圈养,术后12天拆线；

B3、体内缺损填补修复检测；

B31、Micro-CT检测:

术后4、8、12周采用速眠新对青山羊进行麻醉后，行CT检测，同时用相关软件分析骨体积分数(BoneVolume/TotalVolume，BV/TV)、骨密度(BoneMineralDensity，BMD)等指标，并进行缺损部位三维重建以直观了解缺损填补、骨长入及缺损修复情况；

B32、组织形态学观察:

第4、8、12周时处死山羊，取出包含样品的组织制作切片；分别行HE及MASSON三色染色，并于光学显微镜下观察缺损填补、骨长入及缺损修复情况；

HE染色具体步骤为：将切片再次进行梯度脱水后加入苏木精溶液中染色5分钟，流水洗净后采用1％盐酸乙醇处理3秒，再行水洗蓝化30分钟后酒精梯度脱水，并采用伊红染色20秒，采用纯乙醇脱水并经二甲苯使切片透明，中性树胶封固；

MASSON三色染色具体步骤为：将切片进行铬化处理后采用Weiger铁苏木素染色10分钟，用酸性乙醇分化液分化，并用MASSON蓝化液返蓝；随后采用丽春红品红染色液染色10分钟后用磷钼酸溶液分化2分钟，再用苯胺蓝染色液染色2分钟；95％乙醇及无水乙醇依次脱水后，采用二甲苯使切片透明，中性树胶封固；

S4、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的临床研究；

A4、电子束熔融(EBM)3D打印制作个体化多孔金属垫块；

根据外科医生术前规划结果，通过前述办法制备电子束熔融3D打印个体化多孔金属垫块，并采用辐照灭菌后无菌封存以备术中使用；

B4、前期实验都成功后，伦理委员会批准，报批相关手续，建立传统成品人工垫块对照组，进行临床植入试验；

研究对象的筛选:

患者术前拍摄骨盆正位X线片，根据X线片髋臼旋转中心上移程度、坐骨骨溶解、泪滴骨溶解及Kohler线是否破坏等情况对髋臼侧骨缺损进行Paprosky分型评估；

入选标准：PaproskyⅡB及以上严重骨缺损类型；

排除标准：(1)PaproskyⅠ、ⅡA型骨缺损，由于该型骨缺损较小通常无需进行植骨；(2)对金属植入物过敏者；(3)合并其他严重疾病或全身评估不能耐受手术者；(4)伴有髋关节感染或全身其他部位活动性感染者；(5)严重骨质疏松者；(6)除髋关节以外，下肢的其他关节(膝、踝)疾患致功能严重受损影响下肢功能评估者；(7)筛选前6个月有酒精或药物滥用史；(8)怀孕或哺乳期妇女，或期望生育的妇女；

C4、骨盆数字化三维模型的建立

术前采用金属去伪影技术，利用64层螺旋CT对患者的骨盆进行层厚1mm的薄层扫描；CT图像文件以DICOM格式保存,并导入交互式医学影像控制系统,重建患者的骨盆数字化三维模型图；

D4、1:1半骨盆3D模型的制作；

将MIMICS软件建立的数字化三维骨盆模型数据导入工业设计软件UG中进行进一步绘制加工，最后导入到3D打印机主程序中以聚乳酸为原料，按照逐层打印的方式制作出真人大小的1:1半骨盆模型；

E4、骨缺损的评估及手术方案的规划；

根据MIMICS软件获得的三维重建图像及1:1半骨盆3D实体模型进一步评估患者髋臼骨缺损情况，包括髋臼前壁、后壁、内壁、臼顶等的骨缺损量、外形以及残存宿主骨量等情况；根据骨缺损情况，利用计算机辅助设计规划出个性化垫块的三维模型，在重建图像上绘制出其外形、大小及最佳放置位置、螺钉固定数量、方向等，同时确定翻修假体髋臼金属外杯的大小及安装位置，并生成三维效果图；经手术医生确认满意后，根据计算机辅助设计的垫块样式利用EBM3D打印机制作出实体垫块模型，由外科医生在1：1半骨盆模型上进行术前手术操作模拟，评估髋臼骨缺损的预填充效果；

F4、翻修手术置入3D打印内植物重建骨缺损；

经医院伦理委员会批准，告知患者并签署手术及植入物知情同意书；手术均由本课题组医生完成；手术采用改良Harding入路切开暴露，术中彻底清创并取出松动假体，臼杯周围骨溶解和骨缺损与术前3D打印半骨盆模型所示一致；髋臼侧经磨搓后按照术前计划方案在髋臼骨缺损处置入3D打印钛金属垫块，并按术前设计制作的钉孔方向置入螺钉固定；安放金属臼杯，压配牢靠后安装聚乙烯内衬，最后置入生物型股骨柄假体并安装陶瓷球头；

G4、术后临床疗效及生物力学评估:

①与同种异体结构性植骨和使用成品金属垫块的翻修手术建立对照，对比术中时间、出血量、术中并发症情况；

②术后1、3、6、9、12个月对患者进行跟踪随访，评估VAS疼痛评分、Harris功能评分；

③拍摄骨盆X线平片及薄层CT，评估内植物位置以及骨长入情况；

④检测患者血液中V、Al等相关金属离子浓度，评估假体的生物毒性。