[发明专利]病毒检测

权利要求书

1.用于检测和区分样品中的靶病原体甲型流感病毒和乙型流感病毒的试剂盒，其中，分别针对每种病原体，所述试剂盒包含以下组分：

h)引物对，所述引物对包含：

iii.第一寡核苷酸引物，其中该第一寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与病原体来源RNA中的第一杂交序列杂交的区域，和

iv.第二寡核苷酸引物，其中该第二寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与病原体来源RNA中位于第一杂交序列上游的第二杂交序列的反向互补序列杂交的区域；所述第一和第二杂交序列相隔不超过20个碱基；

i)限制酶，所述限制酶不是切口酶，其能够识别第一和第二引物中的所述识别序列并切割所述切割位点；

j)探针对，所述探针对包含：

iii.具有杂交区域的第一寡核苷酸探针，其中所述杂交区域能够与病原体来源RNA存在时产生的扩增产物中的至少一个分子中的第一单链检测序列杂交，并且所述探针连接在允许实现所述探针检测的部分上；和

iv.具有杂交区域的第二寡核苷酸探针，其中所述杂交区域能够与所述扩增产物中的该至少一个分子中位于第一单链检测序列的上游或下游的第二单链检测序列杂交，并且所述探针连接在固体材料上或允许其连接到固体材料的部分上；

其中，至少一种靶病原体的探针对的第一和第二寡核苷酸探针之一在其杂交区域的3’端被封闭以不能通过DNA聚合酶延伸，且不能被限制酶在所述杂交区域中切割；且

所述试剂盒还包含：

k)逆转录酶；

l)链置换DNA聚合酶；

m)dNTP；和

n)一种或多种修饰的dNTP。

2.权利要求1的试剂盒，其中甲型流感和/或乙型流感病毒来源RNA中的第一和第二杂交序列位于或源自所述流感病毒基因组的区段1、2、3、5、7或8之一中。

3.权利要求1或2的试剂盒，用于检测和区分靶病原体甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒，所述试剂盒还包含用于病原体呼吸道合胞病毒的组分a)、b)和c)。

4.权利要求3的试剂盒，其使用相同的引物对和探针对，检测呼吸道合胞病毒A和呼吸道合胞病毒B。

5.权利要求4的试剂盒，其中呼吸道合胞病毒来源RNA中的第一和第二杂交序列位于或源自呼吸道合胞病毒A和B的NS2(非结构蛋白2)、N(核蛋白)、F(融合糖蛋白)、M(基质蛋白)或L(聚合酶)基因之一中。

6.前述权利要求任一的试剂盒，其中每种病原体的探针对的第一和第二寡核苷酸探针之一都在其杂交区域的3’端被封闭以不能通过DNA聚合酶延伸，并且不能被该限制酶在所述杂交区域中切割。

7.前述权利要求任一的试剂盒，其中由于存在一个或多个序列错配和/或一个或多个修饰如硫代磷酸酯键，使得该封闭的寡核苷酸探针不能被限制酶切割。

8.前述权利要求任一的试剂盒，其中该封闭的寡核苷酸探针包含附加区域，使得与该封闭寡核苷酸探针杂交的扩增产物内的该分子的3'端可通过链置换DNA聚合酶延伸。

9.前述权利要求任一的试剂盒，其中病原体的(一种或多种)封闭寡核苷酸探针与用于该病原体的引物对和/或限制酶混合提供。

10.前述权利要求任一的试剂盒，其中用于病原体的探针对的第一和第二寡核苷酸探针都在其杂交区域的3’端被封闭以不能通过DNA聚合酶延伸，且不能被限制酶在所述杂交区域中切割。

11.前述权利要求任一的试剂盒，其中至少一种病原体的第一和第二寡核苷酸探针之一的杂交区域具有与该病原体的第一或第二引物之一的杂交区域或该杂交区域的反向互补序列互补的5个或更多个碱基。