[发明专利]一种薄荷盾状腺毛富集及内含物鉴定方法

权利要求书

1.一种薄荷盾状腺毛富集及内含物鉴定方法，其特征在于：该研究方法具体包括四个步骤，分别为：

S1、采用场发射扫描电镜(SEM)对薄荷叶皮盾状腺毛形态进行观察；

取干燥薄荷叶片，在叶片基部叶脉周围同一部位取约5mm×5mm大小叶片，用导电胶粘附在样品台上，采用离子溅射仪在40mA电流强度下喷金镀膜35s；将喷金镀膜后的样品置于场发射扫描电镜样品仓内，在5～10kV加速电压(EDT)下观察、拍摄腺毛形貌，采用扫描电镜自带测量功能测量并记录腺毛大小；

S2、密度梯度离心法分离薄荷盾状腺毛；

采用密度梯度离心法对薄荷叶片盾状腺毛进行分离和富集，对分离缓冲液组成配比、分离方法进行优化；

S3、建立以激光捕获显微切割分离富集薄荷盾状腺毛的方法学体系；

S4、对薄荷叶片盾状腺毛进行气相-质谱(GC-MS/MS)检测分析；

将LMD切割富集到的盾状腺毛，加入适量乙酸乙酯，超声处理10min，上清液过0.22μm滤膜，上机检测。

2.根据权利要求1所述的一种薄荷盾状腺毛富集及内含物鉴定方法，其特征在于：所述S2中的密度梯度离心法具体为：

研磨器中加入10g新鲜薄荷叶片，再加入200mL分离缓冲液[25mMMOPSO、200mM山梨醇、10mM蔗糖、5mM硫脲、2mM二硫苏糖醇、5mMMgCl2、0.5mM磷酸钠、0.6％(w/v)甲基纤维素、1％(w/v)PVP]，启动研磨器，研磨条件：5次脉冲，20s/每次，每两次研磨时间间隔2～3min，研磨至叶片中肉眼可见无大块碎片；

将研磨所得匀浆过100μm分子筛，去除残渣，用冲洗液(25mMMOPSO、200mM山梨醇、10mM蔗糖、5mM硫脲、2mM二硫苏糖醇、5mMMgCl2、0.5mM磷酸钠)冲洗残留在分子筛滤网上的叶肉组织，共冲洗3～4次，每次用量5～10mL，洗后的溶液合并到滤液中；

滤液继续过70μm分子筛，离心，离心条件：4℃，12000rcf，10min；

离心液弃去上清液后再加入5mL蒸馏水混合，将所得混合液小心加入30mL40％蔗糖溶液顶部，继续离心，离心条件：4℃下，转速650rcf，离心15min，将离心机升速和降速分别设置为5和3。

3.根据权利要求1所述的一种薄荷盾状腺毛富集及内含物鉴定方法，其特征在于：所述S2中的密度梯度离心法具体还可以为：

研磨器中加入10g新鲜薄荷叶片，再加入200mL分离缓冲液[25mM MOPSO、200mM山梨醇、10mM蔗糖、5mM硫脲、2mM二硫苏糖醇、5mM MgCl2、0.5mM磷酸钠、0.6％(w/v)甲基纤维素、1％(w/v)PVP]，启动研磨器，研磨条件：5次脉冲，20s/每次，每两次研磨时间间隔2～3min，研磨至叶片中肉眼可见无大块碎片；

将研磨后的匀浆过纱布去除大块残渣，用冲洗液(25mM MOPSO、200mM山梨醇、10mM蔗糖、5mM硫脲、2mM二硫苏糖醇、5mM MgCl2、0.5mM磷酸钠)冲洗纱布3～4次，每次5～10mL，冲洗液与滤液合并，然后依次过100μm、70μm、40μm孔径的分子筛，移取过分子筛后溶液上层液，在4℃、12000rcf条件下离心10min，去除多余水层。

4.根据权利要求1所述的一种薄荷盾状腺毛富集及内含物鉴定方法，其特征在于：所述S3中的方法学体系是以自然干燥薄荷叶片为实验材料，筛选适宜于薄荷盾状腺毛切割的实验条件。

5.根据权利要求1所述的一种薄荷盾状腺毛富集及内含物鉴定方法，其特征在于：所述S4中的检测条件：采用气相质谱联用(GC-MS/MS)技术检测；AgilentDB-5MS色谱柱(30m×0.25mm×1μm)；流速1.0mL/min；进样口温度：250℃，升温程序：初始温度40℃，以8℃/min升温至260℃，保持2.5min，载气为He；电离方式EI源；接口温度260℃；离子源温度：210℃；电子能量：70eV；扫描速度：2.78s/dec；质量扫描范围(m/z)：40～300amu。