[发明专利]一种基因突变位点的定位方法

权利要求书

1.一种基因突变位点的定位方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：提供第一油相和第一水相，所述第一水相为制备核酸片段N1-N2-UMI-N3的反应体系，混合所述第一油相和所述第一水相形成第一微反应器，将所述核酸片段N1-N2-UMI-N3配置于不同的所述第一微反应器中，使每个所述第一微反应器中配置的所述核酸片段上的UMI标签序列不同；其中所述UMI标签序列为包括8～12个碱基的随机序列，N1、N2和N3分别为包括13～20个碱基的固定序列；

S2：提供包含基因突变位点的样本，将所述样本中的每个模板和所述核酸片段N1-N2-UMI-N3配置于不同的第二微反应器中；

S3：扩增所述模板得扩增产物，使位于一个所述第二微反应器中的所述扩增产物携带相同的所述UMI标签序列，比对所述UMI标签序列，若所述UMI标签序列相同，则所述扩增产物来源于同一个所述模板；若所述UMI标签序列不同，则所述扩增产物来源于不同的所述模板；进而判断所述基因突变位点在所述模板上的定位。

2.根据权利要求1所述的定位方法，其特征在于，所述核酸片段N1-N2-UMI-N3是以核酸片段N2-UMI-N3为模板，载体-N1-N2为上游引物，核酸片段N3’为下游引物经乳液PCR获得的；所述载体被配置为磁珠。

3.根据权利要求2所述的定位方法，其特征在于，所述核酸片段N3’为包括13～20个碱基的固定序列，所述核酸片段N3’与所述N3反向互补配对。

4.根据权利要求2所述的定位方法，其特征在于，所述核酸片段N1-N2-UMI-N3被配置在所述载体上，所述载体与所述核酸片段的5’相连。

5.根据权利要求1所述的定位方法，其特征在于，所述第一微反应器为油包水乳液颗粒，按所述第一油相和所述第一水相的体积比为(3～3.5)：1配制而成；

所述第一油相按稳定剂1：稳定剂2：乳化剂＝75：4：(800～1000)的体积比配制而成；所述稳定剂1包括司盘80、吐温80、吐温60或吐温20中的至少一种；所述稳定剂2包括TritonX-100或TritonX-114中的至少一种；所述乳化剂包括三聚甘油单硬脂酸酯或甘油硬脂酸酯中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的定位方法，其特征在于，步骤S2中，将所述样本中的每个模板和所述核酸片段N1-N2-UMI-N3配置于不同的第二微反应器中的方法为乳液PCR，包括制备所述第二微反应器和PCR扩增。

7.根据权利要求6所述的定位方法，其特征在于，制备所述第二微反应器的方法包括配制第二油相、第二水相，混合所述第二油相和所述第二水相；

配制所述第二油相的方法：按稳定剂1：稳定剂2：乳化剂＝75：4：(800～1000)的体积比配制而成；所述稳定剂1包括司盘80、吐温80、吐温60或吐温20中的至少一种；所述稳定剂2包括TritonX-100或TritonX-114中的至少一种；所述乳化剂包括三聚甘油单硬脂酸酯或甘油硬脂酸酯中的至少一种；

所述第二水相包括引物对、所述样本中的所述模板、所述核酸片段N1-N2-UMI-N3；

所述第二油相和所述第二水相按(3～3.5)：1的体积比混合。

8.根据权利要求7所述的定位方法，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物。

9.根据权利要求8所述的定位方法，其特征在于，所述引物对中，按5’-3’的方向，所述上游引物为F1：N3-A，其中A为扩增所述样本中的所述模板所需的上游引物序列；所述下游引物为R1：N4-N2-B，其中B为扩增所述样本中的所述模板所需的下游引物序列，N4为包括20～23个碱基的固定序列。

10.根据权利要求9所述的定位方法，其特征在于，按5’-3’的方向，所述扩增产物的核酸片段为N1-N2-UMI-N3-Insert-N2’-N4’，其中Insert为扩增引入的插入片段，来源于所述样本中的所述模板；N2’为包括13～20个碱基的固定序列，所述N2’与所述N2反向互补配对；N4’为包括20～23个碱基的固定序列，所述N4’与所述N4反向互补配对。