[发明专利]一种调控种子活力的水稻KOB1基因及其调控方法

权利要求书

1.一种调控种子活力的水稻KOB1基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如序列1所示。

2.一种通过基因工程操纵权利要求1中所述的水稻KOB1基因表达调控种子活力的方法，包括以下步骤：

通过将水稻KOB1基因(OsKOB1)转导至受体水稻或其他植物中，使OsKOB1在种子中过表达或异源表达，从而提高种子活力；

或者，通过CRISPR/Cas9基因编辑方法将水稻或其他植物的KOB1基因敲除，其突变体种子的种子活力就会降低。

3.根据权利要求2所述的通过基因工程操纵水稻KOB1基因表达调控种子活力的方法，其特征在于，所述的将水稻KOB1基因转导至受体水稻或其他植物中的具体方法，包括以下步骤：

1.1克隆去终止密码子的OsKOB1的cDNA序列，构建该基因的pCUbi1390表达载体；

1.2使用花序浸染法将步骤1.1中pCUbi1390表达载体转导入受体水稻或其他植物中，并收获其种子；

1.3将步骤1.2中收获的种子进行消毒后，播种于含有30mg/L潮霉素的1/2MS培养基中；利用载体中包含的编码潮霉素的基因，根据OsKOB1的阳性种子能在该培养基上正常生长，而假阳性种子则在萌发生长一段时间后死亡的原理，筛选OsKOB1过表达或异源表达转基因植株；

1.4将步骤1.3中筛选到的阳性植株移植到自然条件下继续生长发育，待收到种子后，按步骤1.3的方法消毒，再播种于含有30mg/L潮霉素的1/2MS培养基中，待种子萌发后继续筛选阳性株系；将筛选到的阳性株系移植到自然条件下继续生长发育；分别采取阳性株系和野生型植株的叶片，提取总RNA，使用半定量PCR法检测比较转基因株系与野生型植株中KOB1基因的表达量，鉴定出KOB1基因过表达或异源表达株系；并进一步获得阳性株系的种子；

1.5将步骤1.4中阳性株系的种子消毒，按常规栽培和管理方法，繁殖遗传稳定性好的KOB1过表达或异源表达转基因植物株系的种子。

4.根据权利要求3所述的通过基因工程操纵水稻KOB1基因表达调控种子活力的方法，其特征在于，所述步骤1.2中，其他植物为其他农作物、重要野生植物种质资源或有重要研究价值的拟南芥；构建该基因的pCUbi1390表达载体的引物分别序列为：pCUbi1390-OsKOB1-F：TTCTGCACTAGGTACCTGCAGATGCAGTACAAGAACCTGGGGA,如序列2所示；pCUbi1390-OsKOB1-R:CGGGGATCCGTCGACCTGCAGTCTGTATGACTCGGTGCGCTT，如序列3所示。

5.根据权利要求3所述的通过基因工程操纵水稻KOB1基因表达调控种子活力的方法，其特征在于，所述步骤1.4中，半定量PCR法检测比较转基因株系与野生型植株中KOB1基因的表达量采用的引物为：Atactin-F:GCCATCCAAGCTGTTCTCTC，如序列4所示，Atactin-R:GCTCGTAGTCAACAGCAACAA，如序列5所示；OsKOB1-F(正向引物):TCGTCGAACAGCCTGAGTACAACC，如序列6所示；OsKOB1-R(反向引物):GTGAGAACTCCCGAAGCTAGAGGG，如序列7所示。