[发明专利]一种无标记高通量的葡萄糖定量检测方法

权利要求书

1.一种无标记高通量的葡萄糖定量检测方法，其特征在于：以葡萄糖为反应主体，利用葡萄糖氧化酶对葡萄糖催化反应生成过氧化氢，过氧化氢在辣根过氧化酶及溴化钠的催化作用下使得金单质变成金离子，实现对金纳米颗粒的形貌调控，反应最终得到的不同大小形貌的金纳米颗粒，通过纳米孔传感器进行信号检测；将葡萄糖小分子的检测转换为纳米颗粒在纳米孔中的易位信号，电信号的大小和纳米颗粒的形貌成正比，通过调控金纳米颗粒大小实现更高的信噪比，从而实现葡萄糖浓度的高灵敏检测；

所述检测方法具体步骤为：

步骤a，金纳米三角片的合成：将1% 的氯金酸42.5 μL加入到0.1 M的十六烷基三甲基氯化铵4.7 mL中，加入磁子搅拌；然后加入0.01 M的硼氢化钠溶液300 μL，搅拌2分钟后，在25 ℃水浴锅中静止反应2小时，形成5-7 nm的种子溶液;接下来取 0.1 M十六烷基三甲基氯化铵溶液1.6 mL加到8 mL 去离子水中，再加入1% 的氯金酸68 μL和0.01 M 的碘化钾溶液15 μL配制成生长液1；取1% 的氯金酸170 μL加到0.05 M十六烷基三甲基氯化铵溶液8mL中，加入 0.01 M 的碘化钾溶液60 μL配制成生长液2；用0.1 M十六烷基三甲基氯化铵将种子溶液稀释10倍；取0.1 M的抗坏血酸40 μL加入到生长液1中，取 0.1 M的抗坏血酸80 μL加入到生长液2中，使得生长液1，2搅拌至无色；取110 μL稀释后的种子溶液加入到添加过抗坏血酸的生长液1中，摇匀后立刻取640 μL加入到添加过抗坏血酸的生长液2中，将混合溶液摇匀1分钟后，室温下静置反应1小时得未提纯的金纳米三角片溶液；将未提纯金纳米三角片溶液进行分装，每个离心管1 ml，每个离心管中再加入0.78M十六烷基三甲基氯化铵345 μL至终浓度为0.2 M，摇匀混合静置过夜16小时，用移液枪吸取上层红色液体，在底部沉淀物中加入400 μL的水和50 μL十六烷基三甲基氯化铵0.1 M，摇匀混合即为提纯后的金纳米三角片；

步骤b，反应的条件优化：用0.01 M pH=7.4的PBS稀释10 mg/mL 葡萄糖氧化酶和10 mM的葡萄糖溶液，得到0、10、100、1000、2000 μM不同浓度的葡萄糖溶液，同时稀释得到0.5-5mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液, 稀释后的葡萄糖溶液和葡萄糖氧化酶溶液在37℃恒温水浴锅中孵育10 分钟，再分别加入110 mM 辣根过氧化物酶HRP、0.1 M 溴化钠NaBr、1.5 nMAuTNs溶液，再加入0.01 M pH=4的PBS，最终溶液达500 μL，HRP在溶液中的终浓度为1~3mM，溴化钠在溶液中的终浓度为5.5~7 mM， AuTNs在溶液中的终浓度为0.5~1.5 nM，在25℃下孵育15分钟后反应完成，通过透射电子显微镜观测AuTNs形貌变化；

步骤c，标准曲线的绘制：配制0μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM、200μM、1000μM、2000 μM、5 mM、10 mM不同浓度的葡萄糖反应体系，分别加入0.5-5 mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液,在37℃恒温水浴锅中孵育10 分钟，随后加入 110 mM HRP、0.1 M NaBr、1.5 nM AuTNs溶液，再加入0.01 M pH=4的PBS，最终溶液达500 μL，HRP在溶液中的终浓度为1~3 mM，溴化钠在溶液中的终浓度为5.5~7 mM， AuTNs在溶液中的终浓度为0.5~1.5 nM，在25 ℃下孵育15分钟后反应完成，最终得到不同形貌的金纳米颗粒产物，并对最终产物进行纳米孔信号检测；通过纳米孔易位实验，将不同浓度葡萄糖反应体系产物的电信号进行特征提取，对提取的相对电流信号做直方统计图并拟合得到峰位图，根据不同浓度下的峰位值的变化绘制标准曲线；

步骤d，葡萄糖的定量检测：将待测样品与0.5-5 mg/ml的葡萄糖氧化酶在37 ℃下孵育10 分钟，随后加入110 mM HRP、0.1 M NaBr、1.5 nM AuTNs溶液和0.01 M pH=4的PBS溶液，总溶液为500 μL，HRP在溶液中的终浓度为1~3 mM，溴化钠在溶液中的终浓度为5.5~7 mM，AuTNs在溶液中的终浓度为0.5~1.5 nM，室温下孵育15 分钟后将溶液加入纳米孔检测装置，在电压驱动下得到一系列电信号；通过对纳米孔产生的电信号的滞留时间、相对电流进行直方图统计分析，拟合得到相对电流峰值变化，带入标准曲线中，即可得到对应的样品中所含有的葡萄糖浓度，最终实现葡萄糖浓度的定量检测。