[发明专利]一种减少PCR反应中引物二聚体扩增的试剂和方法

说明书

本发明提供了一种减少PCR反应中引物二聚体扩增的试剂和方法及其应用。所述PCR反应试剂中添加了增强剂以减少PCR反应中引物二聚体的形成，特别是能减少多重PCR反应体系中引物二聚体的形成。本发明所述试剂和方法应用于HLA‑B*1502基因多态性的多重荧光PCR中，可有效提高检测的准确性、灵敏度和特异性。

技术领域

本发明涉及在多重聚合酶链式反应(PCR)中有效减少引物二聚体扩增的方法及一种高效检测临床样本中人HLA-B*1502基因多态性的多重荧光(PCR)法试剂盒。

背景技术

多重PCR(Multiplex polymerase chainreaction，MPCR)是在普通PCR基础上，在同一个反应体系中加入不同的引物对，针对不同的模板或同一模板的不同区域进行特异性的扩增，从而得到多个目的片段，结合一定的检测手段进而实现同时对多个靶标进行诊断的技术。自Chamberlain于1988年首次提出这个概念以来， MPCR已经应用于许多领域，包括基因突变与缺失、基因分型与定量、遗传检测、伴药诊断等。MPCR所涵盖的范围广，能够同时对多个靶标进行检测，大幅提升检测效率的同时，还降低了检测成本。

多重荧光PCR(Multiple fluorescence PCR)技术通过荧光PCR技术，利用几种不同荧光基团的组合，结合仪器对不同通道荧光的检测能力实现对多个靶标的实时检测。TaqMan水解探针(Hydrolysis probes)是多重荧光PCR体系中常用的一种探针，探针一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团，通过在不同序列末端标记不同荧光基团及相应的淬灭基团，即可形成不同的TaqMan水解探针，将上述探针及相应的扩增引物加至同一反应体系，即可实现对多个靶标的共同检测。

虽然多重PCR能够同时扩增的靶序列数目没有明确的理论上的限制，但其通常会受制于能够保证结果特异和可判的反应条件的建立。多重荧光定量PCR 技术需将多个引物对、探针以及模板加入到同一个反应管中进行反应，伴随检测重数的增加，同管内核苷酸链数目也会增加，各核苷酸链之间互搭形成二聚体甚至多聚体的可能性大幅上升，轻则导致非特异性扩增的出现，靶标扩增效率下降，检测灵敏度和特异性降低，重则导致非特异性扩增占据主导，靶标扩增失败，造成检测结果假阳性和/或假阴性。

引物二聚体由彼此杂交的引物分子组成，杂交的原因是成串的互补碱基，特别是在引物的3’端。一旦形成，短的二聚体倾向于非常有效地扩增，通过大量消耗引物和其他试剂潜在地抑制所需DNA序列的扩增。因此，设计引物时应综合考虑引物长度、GC含量及引物与靶序列的同源性；引物的退火温度应较为接近，以使各引物对其相应的靶序列有相同的扩增效率。由于Taq DNA聚合酶是Mg²⁺依赖酶，dNTP、引物也都依赖于Mg²⁺，所以最佳Mg²⁺浓度应依据dNTP浓度、模板DNA量及缓冲液组分来确定。D’Aquila等在1991年首次提出了热启动PCR 的概念，通过在一个高于引物退火温度的温度混合反应液，显著增加了特异产物的扩增量和PCR的特异性。随后发展起来的多种热启动PCR方法均能有效减少或消除PCR中的非特异产物尤其是引物二聚体的产生。