[发明专利]一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一重组人源Ⅲ型胶原蛋白及其应用。本发明对人全长Ⅲ型胶原蛋白进行优化，选取一段含有123个氨基酸序列区段，并将该区段序列中三肽序列Gly‑Pro‑Hyp定向替换为Gly‑Pro‑Arg序列，并对其进行4重复，同时在‑C末端连接GPPGPCCGGG序列，该重组蛋白具有三级螺旋结构，显现出更强的稳定性，且具有接近天然胶原的性质。所述重组人源Ⅲ型胶原蛋白可以在毕赤酵母中有效稳定和大量表达，同时C端连接6个组氨酸特异性亲和纯化标签，易于获得高纯度产品，能够适应于工业化的大规模生产。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白及其应用。

背景技术

胶原蛋白又称胶原，是一种糖蛋白，人体皮肤内胶原蛋白为I型胶原和III型胶原，I型胶原主要存在于成人皮肤、肌腱、骨组织，Ⅲ型胶原主要存在于婴儿皮肤或血管内膜、肠道，I型胶原和III型胶原与皮肤损伤修复过程和修复质量紧密相关。III型胶原具有优秀的生物学活性和组织相容性，能促使真皮层成纤维母细胞增生，提高细胞活性，并被成纤维细胞作为合成胶原蛋白的原料吸收，刺激细胞更多的合成胶原蛋白、使受损老化的皮肤得到填充和修复，重建网状结构，增强受损皮肤的扩张力，恢复皮肤弹性。III型胶原蛋白由三条肽链向右卷曲扭成的三股螺旋状。一级结构分析表明，其多肽链很长的区段序列是由GLy-x-y氨基酸序列重复而成。其中，x通常为脯氨酸，y通常为羟脯氨酸和羟赖氨酸，这种三肽重复序列对胶原蛋白的结构起着很大的作用。

目前市场上销售的胶原蛋白产品大都是取自猪、牛和鱼等动物组织，进而通过酸、碱、酶解法处理得到，其生物学活性远远不及人体天然胶原蛋白，不能满足医药、食品和化妆品等行业需求。

随着DNA重组技术的迅速发展，人们开始探索利用重组技术获得III型人源胶原蛋白。利用生物基因工程技术，把胶原蛋白中的一部分mRNA逆转录，得到合适的cDNA序列后，再优选合适的载体表达，经过双酶切处理后，转移到各种宿主细胞中诱导表达得到高分子蛋白，并经过分离、复性、纯化后获得所需要的生物蛋白。

目前，重组III型胶原的主要以大肠杆菌为重组胶原蛋白的表达系统，如CN110194795A公开了一种重组人源胶原蛋白及其应用，选取了人源三型蛋白保守区域的一段序列并将其重复8次，将设计得到的序列重组构建原核表达载体pET22b中，经过诱导表达，最终得到了能够在大肠杆菌中高效表达的，可溶于水的重组人源胶原蛋白。CN103122027A公开了一种重组人源胶原蛋白及其生产方法，结构为单链结构，基本重复单元为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap，为人胶原蛋白III型肽段，末端序列为GPPGPCCGGG，为人胶原蛋白II型肽段，采用大肠杆菌表达系统。

CN111363029A一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法，从已知序列的人体胶原蛋白基因III型的螺旋区中选择水溶性、稳定性强的核苷酸序列，将优选基因片段插入毕赤酵母表达质粒中，转化毕赤酵母筛选得到高

随着现代生物技术的发展，国内外陆续有公司或研究单位开始开发重组类胶原蛋白的生产技术，如利用转基因的方法，国外公司培育出含类人胶原蛋白的小白鼠，美国胶原公司将特定的乳腺表达系统微量注射到受精卵母细胞后，一直到哺乳动物母体，使其怀胎足月，得到含有重组类人胶原蛋白乳汁的哺乳动物，但是通过哺乳类或昆虫细胞株生产成本极高、生产周期长，而且昆虫细胞和部分哺乳动物中没有足够水平的P4H。研究人员尝试利用微生物来生产类胶原蛋白，因为该方法的生产成本相对较低。但在大多数的大肠杆菌和酵母中其自身不能合成P4H，因而不能形成Hyp残基。为了得到稳定的三重螺旋结构，并具有良好生物活性的胶原蛋白，国内外研究者主要从以下两个方面开展研究：1.含有Hyp残基的类胶原蛋白，促进Hyp形成的P4H存在于内质网腔中，脊椎动物的P4H是由α2β2构成的四聚体，每一个α亚基包含一个将Pro羟化的催化位点。虽然Hyp对胶原蛋白三重螺旋结构的稳定期这非常重要的作用，但在许多情况下，Hyp还是非常难以获得的。2.不含Hyp的类胶原蛋白，以期在Hyp缺失的情况下，促进类胶原蛋白三重螺旋结构的形成与稳定。