[发明专利]一种磷酸化反应的检测方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种用于检测T4 PNK磷酸化效率的方法及试剂盒，其包括：使用T4 PNK酶对dsDNA进行磷酸化，得到5′端磷酸化产物；使用具有识别5′端磷酸化的dsDNA并对其进行外切的酶对磷酸化产物进行酶切，得到酶切产物；最后测定酶切产物的量；该方法能够稳定而准确的检测出T4 PNK酶磷酸化效率。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种磷酸化反应的检测方法及试剂盒。

背景技术

DNA的磷酸化操作是分子生物学实验的重要操作步骤，在众多生产、实验中是保障结果的关键步骤。例如，在高通量测序文库郭建过程中，磷酸化是构建DNA文库关键步骤，具体包括：步骤A将片段化的DNA进行片段的末端及磷酸化，其中使用T4PNK进行磷酸化，磷酸化效率将是影响接头连接成功的关键因素，会影响整个建库过程。

T4PolynucleotideKinase，简称T4PNK，中文名称T4多聚核苷酸激酶，是一种多聚核苷酸5'羟基激酶，可以催化NTP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基转移。产生如下的磷酸化反应：5'-OH+NTP→5'-P+NDP。可用于寡核苷酸、DNA或RNA的5’末端标记或磷酸化。目前，对于T4PNK酶活性测定的常规方法主要包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、放射自显影、自由基同位素³²p标记技术等。但这些方法存在复杂、耗时、通量低、潜在的放射性危害等缺陷。

在实际生产、试验过程中，往往要检测待检样品对DNA的磷酸化效率，由此需要与生产试验场景需求相适应的检测方法、试剂盒以及质检设备。但是目前的手段往往检测效率低、流程繁琐且制备预检品的品质稳定性差，质检操作时间长、操作复杂难以提高检测通量以满足生产实验中质量控制的实际要求。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供了一种磷酸化反应的检测方法及试剂盒，本发明通过偶联磷酸化反应和具有末端磷酸化识别活性的酶切反应，根据测定酶切反应产物的量构建连酸化反应效率检测模型，能够稳定有效的高通量处理磷酸化反应效率的质控。

1.一种检测磷酸化反应的方法，其包括：

步骤Ⅱ：质控品的磷酸化反应，磷酸化反应体系中磷酸化酶在对质控品进行磷酸化，得到磷酸化产物；

步骤Ⅲ：酶切反应，酶切反应体系中有末端磷酸基团识别功能的核酸外切酶对磷酸化产物进行酶切，得到酶切产物；

步骤Ⅳ：测定酶切产物的量。

2.根据项1所述的方法，所述磷酸化反应体系中磷酸化酶为具有DNA5’末端磷酸化活性的酶，优选为T4 PNK酶。

3.根据项1所述的方法，所述酶切反应体系中核酸外切酶为具有DNA5’末端磷酸基团特异性识别功能并对其进行顺序外切水解产生单核苷酸的酶,优选为为λexo酶。

4.根据项1所述的方法，所述质控品为任意来源的ssDNA或dsDNA，优选为dsDNA。

5.根据项4所述的方法，所述质控品的磷酸化反应还包括阴性对照组反应、待测反应和阳性对照组反应，阴性对照反应和待测反应使用阴性质控品，阳性对照反应使用阳性质控品；

所述阴性质控品和阳性质控品为序列相同的dsDNA片段，阴性质控品为5’端带有磷酸基团的dsDNA片段，阳性质控品为5’端已经磷酸化的dsDNA片段。

6.根据项1～5中任一项所述的方法，所述方法步骤Ⅱ前还包括：步骤Ⅰ质控品制备。

7.根据项1所述的方法，所述测定酶切产物的量为任一能实现对酶切产物进行峰图检测和/或浓度检测的方法。