[发明专利]一种GLP-1类似物的纯化方法及其应用

说明书

本发明公开了一种GLP‑1类似物的纯化方法及其应用。其中，纯化方法包括：将粗肽溶液进行反相纯化、用水和有机溶剂的混合溶液作为流动相，进行脱盐得到GLP‑1类似物精肽溶液、调节pH至3.5～5.5，在‑20～25℃温度下析出。本发明提供的纯化方法在反相纯化后不进行减压浓缩或膜浓缩，而是脱盐、调节pH后直接析出，无需旋蒸，一方面降低了生产成本和能耗，提高效率；另一方面，本发明得到的纯化产品为固体，稳定性良好，可长久保存不易降解，方便转移；除此之外，本发明提供的纯化工艺简单高效，析出率高，利于大规模生产。

技术领域

本发明涉及多肽药物的纯化技术领域，尤其涉及一种GLP-1类似物的纯化方法及其应用。

背景技术

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，是由肠道细胞分泌的一种肠源性激素。GLP-1可以以葡萄糖浓度依赖的方式促进胰岛β细胞分泌胰岛素，并减少胰岛α细胞分泌胰高血糖素，从而实现血糖的下降，同时还具有减轻体重、保护心血管等作用。由于人体自身产生的GLP-1半衰期极短，在几分钟内即会被二肽基肽酶4所降解，限制了GLP-1的临床应用。对此，制药企业研发了一系列GLP-1类似物，用于二型糖尿病的治疗，如艾塞纳肽、度拉糖肽、利司那肽、贝那鲁肽、聚乙二醇洛塞那肽、利拉鲁肽、司美格鲁肽等。与GLP-1相比，GLP-1类似物能够抵抗二肽基肽酶4的降解，在人体内的半衰期更长，生物活性更强，具有良好的临床应用效果和安全性。

现有技术中，关于GLP-1类似物的纯化工艺，最后一步纯化通常为反相纯化。反相纯化的样品含有大量有机溶剂，如乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇等，需要通过减压浓缩或膜浓缩的方式去除大部分有机溶剂，同时提高样品浓度后，才能进行冻干，得到GLP-1类似物原料药。例如，专利CN202010825323、CN201910685603和CN201711474148中，完成反相纯化后，均进行了减压浓缩或膜浓缩的操作。当纯化规模放大时，减压浓缩或膜浓缩的耗时很长，且需要相应的设备，在规模化生产、纯化效率、纯化成本上并无优势。专利US6844321B2，介绍了一种GLP-1类似物的析出方法，主要是利用样品浓度、盐、有机溶剂、缓冲盐、pH、温度参数的组合进行结晶析出，整个析出过程较为复杂，需要应用多种试剂。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种GLP-1类似物的纯化方法及其应用。对经过反相纯化、脱盐后的GLP-1类似物精肽溶液进行析出，得到GLP-1类似物晶体，复溶、冻干，最终得到GLP-1类似物原料药。一方面，避免使用耗时较长的减压浓缩或膜浓缩工艺，提高了纯化效率，同时析出晶体的稳定性更优、能长期保存，不易降解；另一方面，本发明的析出工艺更为简便和高效，析出率高，利于大规模生产。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一方面，本发明提供一种GLP-1类似物的纯化方法，包括如下步骤：

步骤一，反相纯化：将含GLP-1类似物的粗肽溶液进行一次纯化，以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以碳酸氢铵水溶液A1和乙腈B作为流动相，进行梯度洗脱；将一次纯化得到的馏分进行二次纯化，以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以磷酸水溶液A2和乙腈B作为流动相，进行梯度洗脱；

步骤二，脱盐：将步骤一得到的馏分，用水和有机溶剂的混合溶液作为流动相，进行脱盐，得到GLP-1类似物精肽溶液；

步骤三，析出：将步骤二得到的GLP-1类似物精肽溶液的pH调至3.5～5.5，在-20～25℃温度下析出。

作为优选地实施方式，步骤一中，所述含GLP-1类似物的粗肽溶液为GLP-1类似物的氨水溶液；

不同GLP-1类似物的物理性质有所差异，可以通过调节粗肽溶液的pH控制其溶解度。在某些具体的实施方式中，为了使粗肽完全溶解，对于GLP-1类似物，利拉鲁肽粗肽溶液的pH控制在8.0～9.0，司美格鲁肽粗肽溶液的pH控制在7.0～8.0。