[发明专利]适配体功能化UCST型温敏嵌段聚合物及其同步分离纯化、固定化细胞色素C的应用

说明书

本发明的目的在于提供一种适配体功能化UCST型温敏嵌段聚合物的制备方法，及其同步分离纯化、固定化细胞色素C(Cyt c)的应用。本发明结合了适配体对酶的高特异性识别、高亲和力以及UCST型温敏嵌段聚合物的温度刺激响应性能，突破了现有分离纯化技术的局限性，实现了猪心肌细胞粗提液中Cyt c的高效、选择性同步分离纯化、固定化。在最优条件下，Cyt c的分离效率为90.2％，所得的固定化Cyt c在高温、碱性环境中展现出了良好的稳定性，并表现出均相催化、异相高效、快速回收的优势。本发明制备的适配体功能化UCST型温敏嵌段聚合物可广泛应用于高效、选择性同步分离纯化、固定化酶，是降低工业用酶成本的有效方法。

技术领域

本发明属于聚合物及其制备方法技术领域，涉及适配体功能化UCST型温敏聚合物的制备及其同步分离纯化、固定化细胞色素C(Cyt c)的应用。

背景技术

酶制剂主要是从动物、植物、微生物体中提取、分离、纯化、加工得到的一定纯度、催化活性的蛋白质产品。酶粗提液中含有大量的杂蛋白、小分子糖、氨基酸等组分，要从组分复杂的粗提液中分离纯化得到较高纯度的目标酶极具挑战。常用的分离方法为先采用盐析沉淀法、有机溶剂沉淀法等粗级分离方法，去除大部分杂质；其次，采用膜分离、层析技术、电泳分离等细级分离方法，获得较高纯度酶。这些传统的分离方法具有操作复杂、分离成本高等缺点，无法满足简单、高效分离纯化酶的需求。酶的结构易受到温度、酸碱度、有机溶剂等因素影响而失去催化活性，并且酶具有稳定性差、不能重复使用等缺点限制了其工业化应用。因此，酶的同步分离纯化、固定化研究逐渐成为研究的新方向。基于标签与活性基团的特异性相互作用，通过重组DNA技术在靶蛋白引入标签，同时在载体材料上修饰活性基团，可达到从粗提液中同步分离纯化、固定化靶蛋白的目的。可在实际操作过程中，仍存在操作复杂、成本高等不足。急需发展高效、选择性从酶粗提液中直接同步分离纯化、固定化酶的方法。

适配体是一类经过人工合成并从寡核苷酸文库筛选出来的单链核苷酸(ssDNA和ssRNA)。适配体在结合靶分子时会首先自适应折叠形成相应的识别结构，如发夹、凸环等，然后通过形状匹配、静电、氢键等多重作用力高特异性识别作用靶分子。研究表明，当靶分子是大分子蛋白质的时候，适配体能通过多位点结合蛋白质，使适配体-蛋白质复合物的解离常数达到皮摩尔级，结合接近不可逆结合。基于适配体高特异性识别、高亲和力，可将其作为亲和配体接枝到载体材料上，达到同步分离纯化、固定化酶的目的。

合适的固定化酶载体可以显著改善固定化酶的特性，具有最高临界相转变温度(UCST)的温敏聚合物，在感受到外部环境温度变化时，可以实现从可溶状态到不可溶状态的可逆相变。以该类聚合物作为固定化酶的载体材料，可通过温度刺激响应实现固定化酶高效、快速的回收和循环利用。因此，为实现直接从酶粗提液中高效、选择性的同步分离纯化、固定化酶，可将具有高特异性识别和高亲和力的适配体修饰到UCST型温敏聚合物，制备适配体功能化UCST型温敏聚合物，以有效降低酶制剂的生产和应用成本，同时通过适配体的自适应性构象改变保持酶的活性。

发明内容