[发明专利]两株野生酵母及其在改善果酒颜色稳定性中的应用

权利要求书

1.一株酿酒酵母，其特征在于，保藏编号:CGMCC No.22751。

2.一株异常威克汉逊酵母，其特征在于，保藏编号:CGMCC No.22753。

3.如权利要求1所述的酿酒酵母和如权利要求2所述的异常威克汉逊酵母在生产富含矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、锦葵素-3-O-葡萄糖苷等花色苷单体的葡萄酒、桑椹酒、蓝莓酒等果酒中的应用。

4.一种生产葡萄酒、桑椹酒、蓝莓酒等果酒的方法，是利用如权利要求1所述的酿酒酵母和如权利要求2所述的异常威克汉逊酵母通过单菌株/顺序/混合接种发酵葡萄、桑椹、蓝莓等果实原料，得到富含花色苷的果酒。

5.一种高通量筛选具有高产羟基肉桂酸脱羧酶(HCDC)特征的酵母的方法，可得到如权利要求1所述的酿酒酵母和如权利要求2所述异常威克汉逊酵母，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取出在甘油管中冻存的菌株，解冻后按照5％-10％的比例接种于液体YPD培养基中，28℃，160r/min培养24h；

(2)用蛋白胨水稀释(1)培养的菌液，选取合适的稀释度，取0.1mL菌液涂布于灭菌后的WL鉴别培养基上，28℃静止培养48h；若WL鉴别培养基出现杂菌污染，用接种环挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，重复上述步骤，直至得到纯化菌株；

(3)用接种环挑取WL平板上的目标单菌落接种到液体YPD培养基中培养，用0.9％生理盐水调整菌液密度OD₆₀₀为0.8-1.2；

(4)向96深孔板每孔添加适量HCDC酶活筛选培养基，将(3)所得已调整菌液密度的菌液接种到深孔板中，接种量为8％-12％，每种菌液接种3个孔作为平行试验，记录好每个板孔所对应的单菌落编号，用无菌盖覆盖深孔板，25-28℃恒温培养箱中发酵培养6-10天；

(5)培养结束后，样品离心；用超高效液相色谱(UPLC)检测发酵结束后菌液中酶底物对香豆酸浓度，从而对不同菌株产HCDC能力进行初步评价，以不添加酵母发酵的无菌培养基为对照，筛选出具有较高HCDC酶底物利用效率的特征菌株；

(6)对(5)初筛得到的菌株重复(1)-(4)的步骤进行菌株发酵培养，培养结束后，样品离心，用UPLC检测发酵结束后菌液中HCDC底物对香豆酸和中间产物4-乙烯基苯酚的浓度，根据测定结果，最终筛选得到具有高HCDC活性的酵母菌株。