[发明专利]突变的黑曲霉菌株及其应用

说明书

本发明涉及突变的黑曲霉菌株及其应用。具体地，本发明涉及突变的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株，其是乳清酸磷酸核糖基转移酶营养缺陷型菌株，并且其相对于未突变的菌株，内源酶，优选溶血磷脂酶的生产能力提高。本发明还涉及所述菌株的各种应用。

技术领域

本发明涉及微生物领域，更具体涉及突变的黑曲霉菌株和采用该菌株得到的重组菌株、生物催化剂等，以及用该菌株生产外源蛋白的方法。

背景技术

黑曲霉 ( Aspergillus niger ) 属于子囊菌亚门、丛梗孢科、曲霉属真菌的常见种，也是自然界中最为常见的丝状真菌，在植物性产品、粮食和土壤中广泛分布。其分生孢子头为黑褐色放射状，球状顶囊，分生孢子梗长短不一，菌丝发达，多分支。黑曲霉能够通过降解自然界中的有机质并吸收其中的营养物质而快速生长。黑曲霉被美国食品与药品管理局（FDA）列为GRAS( Generally Regards As Safe) 级别并得到了世界卫生组织的认可，是丝状真菌中应用非常普遍的种属。由于黑曲霉能够产生酶制剂和有机酸，因而成为重要的工业生产菌株。

黑曲霉具有高效的蛋白分泌表达能力。黑曲霉表达外源蛋白具有表达量大、胞外分泌率高、蛋白质分子折叠和修饰系统接近高等真核细胞等特点，且表达的外源蛋白具有天然活性。另外，黑曲霉还能进行各种翻译后加工，如糖基化修饰蛋白酶切割和二硫键的形成等。因而，利用黑曲霉作为一个表达菌株来表达同源和异源蛋白日益受到重视。目前利用黑曲霉生产的商业酶制剂包括食品、洗涤、纺织和造纸等工业中用到的淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、植酸酶和木聚糖酶等，通过其表达的异源蛋白有溶菌酶、白细胞介素-6、人乳铁蛋白、牛凝乳酶、奇异果甜蛋白、脂肪酶等。

在中国应用于食品中的酶制剂必须符合中华人民共和国国家标准GB2760-食品国家标准\食品添加剂使用标准，其中符合法规的异源表达食品用溶血磷脂酶（黑曲霉来源）只能由黑曲霉来进行异源表达。

因此，本领域仍然需要能够高效表达各种蛋白，尤其是食品用溶血磷脂酶的黑曲霉菌株。

发明内容

本发明以黑曲霉CICC2243为出发菌株，构建了乳清酸磷酸核糖基转移酶营养缺陷型菌株( pyrE ^- )菌株，再通过ARTP诱变筛选到了一株在添加了尿嘧啶的溶血磷脂酶筛选平板上, 与诱变出发菌株相比沉淀圈明显变大的菌株，其自身溶血磷脂酶（LPL）酶活提高了10.8倍。进行重组表达溶血磷脂酶LPL发现其表达能力有明显的提升，相对于出发菌株，提高了112%。该菌株可以用来高效异源表达各种蛋白，尤其是食品用溶血磷脂酶。

具体地，本发明涉及以下方面。

一方面，本发明涉及突变的黑曲霉 ( Aspergillus niger )菌株，其是乳清酸磷酸核糖基转移酶营养缺陷型菌株，并且其相对于未突变的菌株，内源酶，例如溶血磷脂酶的生产能力提高。例如，可以提高10-15倍，例如10-12倍，特别是10.8倍。

在本发明中，术语“内源酶”指的是突变的黑曲霉 ( Aspergillus niger )菌株自身表达的酶，例如，包括但不限于突变的黑曲霉菌株自身表达的溶血磷脂酶。

在一个实施方案中，本发明的突变的黑曲霉的乳清酸磷酸核糖基转移酶pyrE基因第64和65位的核苷酸TT缺失。

在一个实施方案中，本发明的突变的黑曲霉菌株具有CGMCC No. 40011的保藏号。