[发明专利]一种产虾青素的工程菌及其制备方法和应用

说明书

本申请公开了一种产虾青素的工程菌及其制备方法和应用，产虾青素的工程菌的基因组中包括β‑胡萝卜素酮化酶基因和β‑胡萝卜素羟化酶基因，能够将β‑胡萝卜素转化为虾青素。产虾青素的工程菌的制备方法包括：采用CRISPR/Cas9操作系统或随机整合的方法将β‑胡萝卜素酮化酶基因和β‑胡萝卜素羟化酶基因分开或串联敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母工程菌的基因组中。通过该产虾青素的解脂耶氏酵母工程菌的发酵并优化发酵条件，可以实现虾青素的高产，且虾青素为3S‑3’S构型虾青素。构建得到的工程菌株和产物具有良好的生物安全性，生产工艺简单、周期短、质量好，可应用于多种领域产品。

技术领域

本申请涉及合成生物学及发酵工程技术领域，具体涉及一种产虾青素的工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

虾青素是一种天然存在的类胡萝卜素化合物，具有强抗氧化性和红色赋色性能，是唯一可以穿透血脑和血视网膜屏障并对中枢神经和脑功能有积极作用的类胡萝卜素，可广泛应用于水产养殖、禽蛋业、化妆品、保健品等领域。

虾青素的天然生产者包括某些种类的藻类、细菌、真菌和植物等，另外虾蟹也会因食用含有虾青素的藻类而在壳中富集虾青素。但上述生物体中虾青素含量很低，培养和提取工艺过程复杂低效，严重阻碍了虾青素的市场应用。化学合成法因价格较低，目前是虾青素主要的生产方式，但因其含有多种光学异构体，安全性存疑，且生产过程污染严重，美国食品与药品监督管理局(FDA)己禁止化学合成虾青素进入保健品领域，只允许3S-3’S构型的虾青素进入食品和保健品领域，大大限制了化学合成虾青素的应用领域。

虾青素生物合成途径分为两部分：通过甲羟戊酸途径(MVA途径)和2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸合成途径(MEP途径)合成的异戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，经多步反应合成番茄红素，进而合成β-胡萝卜素；β-胡萝卜素可在β-胡萝卜素酮化酶(CrtW)及β-胡萝卜素羟化酶(CrtZ)的作用下被转化得到终产物3S-3’S型虾青素。

多种藻类如雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、佐芬根绿球藻(Chromochloris zofingiensis)、细菌如菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、海洋细菌(Agrobacterium aurantiacu)等中均存在由β-胡萝卜素经CrtW和CrtZ生物合成3S-3’S型虾青素的天然途径。

本申请使用的解脂耶氏酵母是一种奶制品中常见的酵母菌，通过了一般性安全认证GRAS(Generally recognized as safe)。其特点是能利用多种碳源包括油脂，并能在胞内大量合成和积累油脂。所以解脂耶氏酵母胞内有丰富的乙酰辅酶A作为类胡萝卜素合成的前体，并有足够的存储空间，非常有利于脂溶性类胡萝卜素的生产。在解脂耶氏酵母底盘细胞中引入虾青素合成途径来生产虾青素，赋能解脂耶氏酵母生产出天然宿主不具备的高质量虾青素，已成为目前研究的热点之一。之前已有一些专利和文献通过在解脂耶氏酵母中引入异源途径基因实现了番茄红素和β-胡萝卜素等类胡萝卜素的合成。但番茄红素和β-胡萝卜素本身在植物中含量丰富，价值较低，所以由工程菌发酵生产的价值不高。还有一些文献和专利也通过继续引入从β-胡萝卜素到虾青素的异源途径实现了虾青素在微生物中的合成，宿主主要为大肠杆菌、酿酒酵母等，但这些工程菌仍然存在虾青素产量较低的问题。另外，大肠杆菌存在内毒素引起的安全性问题，不足以应用于工业化生产。因此开发高产虾青素的解脂耶氏酵母合成生物学工程菌具有重要的应用价值。

发明内容

本申请提供一种产虾青素的工程菌及其制备方法和应用，可以实现生物发酵法虾青素的高产。