[发明专利]一种脱细胞基质生物材料的制备方法

说明书

本申请提供了一种脱细胞基质生物材料的制备方法，采用特定的前处理、脱脂、消毒、脱细胞、去α‑Gal抗原以及灭菌的方法相结合，在有效去除动物组织抗原性物质的同时，还能最大限度的保留材料中生物活性成分和结构的完整性，从而获得一种具有低免疫原性、高生物活性的脱细胞基质生物材料。此外，采用本申请的方法制备的脱细胞基质生物材料有效降低了免疫原成分，具有良好的生物相容性和生物安全性，表面有利于细胞粘附、聚集、增殖，其可以作为一种高活性的生物基质材料应用于皮肤软组织缺损、牙龈退缩及牙周软组织的修复。

技术领域

本申请涉及生物医用材料技术领域，特别是涉及一种脱细胞基质生物材料的制备方法。

背景技术

脱细胞基质生物材料是用适当的方法将组织/器官进行脱细胞处理，去除组织中可能引起排斥反应的细胞及其他抗原分子，保留三维结构和功能蛋白，具有生物诱导功能，可以在体内/体外形成特定的功能化组织，可用于组织损伤修复/重建的一种新型生物材料。目前应用较多的脱细胞生物材料主要是异种去细胞基质，这类天然生物材料的原材料主要来源于动物小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、心包膜、羊膜、腹膜及真皮层。脱细胞基质生物材料广泛应用于医药领域，相比不可吸收材料或者传统的高分子材料，它具有诱导组织再生的能力，因此被认为是理想的组织修复材料。但动物源性生物材料也存在一些风险，一方面在于其携带的外源残留DNA、脂肪等免疫原性物质，在植入人体后可能会引起免疫反应；另一方面在于其处理过程中用到的试剂容易破坏细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的三维结构，使其在体内失去了诱导组织再生的能力。

关于脱细胞基质中的有效活性成分，因使用不同的去细胞试剂或方式，脱细胞基质中保留的有效活性成分差异很大。现有技术中的去细胞方法主要有：1)物理法：例如反复冻融法，此方法属于物理方法进行脱细胞处理，由于其所需周期太长，现在基本已经不用；2)化学法：主要有酸、碱、除垢剂(也称表面活性剂)，除垢剂例如SDS、Triton X-100、CHAPS，上述都是化工合成或半合成的，去污力强，去细胞效果好，但是通常采用这类去细胞试剂制备的生物补片，其保留的有效活性成分少，ECM立体结构损伤大，因此其诱导组织再生能力差，另一方面，加工助剂残留会导致细胞毒性、刺激和免疫反应，从而影响组织修复效果，专利CN101366975公开了一种脱细胞小肠粘膜下层生物材料的制备方法，其中使用0.1-1M的NaOH进行脱细胞，但是由于NaOH为强碱性试剂，对ECM的胶原结构影响较大，同时NaOH进行脱细胞对ECM结构的破坏导致材料降解较快以及对ECM中生长因子的去除，可能会影响到细胞在基质材料上聚集、增殖和分化的再细胞化过程，从而影响到基质材料引导组织再生的能力；3)酶法：包括蛋白酶消化、核酸酶消化和钙螯合物试剂的使用等，胰蛋白酶是脱细胞过程中最常用的酶，专利CN 110433341在其背景技术中指出“与去污剂比较而言，胰蛋白酶去除细胞的效果也相对较缓慢，同时对ECM中的胶原蛋白和弹力蛋白有着更大的破坏性，即造成对ECM超微结构的破坏，从而直接导致ECM机械性能的下降”；中性蛋白酶也常用于脱细胞过程，但是长时间作用会破坏ECM的超微结构，会降解ECM中纤维连接蛋白和IV型胶原；专利CN 106563173公开了一种脱细胞生物真皮材料的制备方法，其中使用了加有EDTA的胰蛋白酶溶液、中性蛋白酶溶液以及除垢剂溶液进行脱细胞，脱细胞效果良好，但是生物活性成分保留较少，有可能不易于细胞在胶原材料表面粘附、增殖生长，从而影响到基质材料引导组织再生的能力。

发明内容

动物源性生物材料处理工艺的难点在于，如何在去除动物组织携带的免疫原性物质的同时，尽可能的降低对ECM的破坏。因此，如何清除免疫原性物质，提高生物材料结构稳定性，提升生物活性成分的保留，这是目前制备脱细胞生物材料的研究重点。

有鉴于此，本申请的目的在于提供一种脱细胞基质生物材料的制备方法，以实现免疫原物质的高效清除，以及更少地破坏ECM的成分和结构。

本申请第一方面提供了一种脱细胞基质生物材料的制备方法，其包括以下步骤：