[发明专利]一种木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法及其应用

权利要求书

1.一种木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法，其特征是：将待染色木本植物根内丛枝菌根进行组织切片，使得切片厚度为60μm～100μm，将所得的切片进行染色处理。

2.根据权利要求1所述的一种木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法，其特征是：最佳切片厚度为80μm。

3.根据权利要求1所述的木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法，其特征是：所述组织切片的步骤包括选取长度为0.5cm～2cm左右的受丛枝菌根真菌侵染的木本植物根段，用低熔点琼脂糖将其包埋并固定在载玻片上，使用振动切片机Leica VT1000 S进行切片，切片程序为：切片速度0.165mm/s～0.175mm/s，切片频率为40Hz～60Hz。

4.根据权利要求1所述的木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法，其特征是：所述染色处理的方法为台盼蓝染色法，所述台盼蓝染色法包括以下步骤：

a)消化：将切片加入6％～10％(W/V)KOH，以80℃～90℃水浴50min～60min，除去细胞中的细胞质；

b)酸化：将切片取出冲洗干净后，加入0.15M～0.2M HCl，室温放置4min～5min；

c)染色：加入0.03％～0.05％(W/V)台盼蓝染液染色，室温染色6min～10min；

d)脱色：置于脱色液中脱色1d～2d，使非丛枝菌根真菌结构脱色；

e)观察和拍照记录。

5.根据权利要求4所述的木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法，其特征是：所述步骤d)中，所述脱色液由乳酸、甘油和蒸馏水混合获得，其中乳酸、甘油和蒸馏水的体积之比为(1～2)：(1～2)：(1～2)。

6.根据权利要求1所述的木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法，其特征是：所述染色处理的方法为双重荧光染色，所述双重荧光染色法包括以下步骤：

a)漂白：将切片置于40％～50％(W/V)的乙醇中孵育1h～3h，漂白根系；

b)透明：加入15％～20％(W/V)KOH溶液孵育1d～2d，使根系透明；

c)染色：将切片取出并使用pH 7～7.4的PBS缓冲液冲洗干净后，加入0.15ug/ml～0.2ug/ml AlexaWGA 488荧光染料，室温孵育10h～15h，随后加入0.1ug/ml～2ug/mlSigma-Nile Red荧光染料，抽真空孵育20min～30min；

d)清洗：用pH 7～7.4的PBS缓冲液震动清洗3次以上，以洗去浮色；

e)观察和拍照记录。

7.一种木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法的应用，其特征是：采用权利要求1-6任一项所述的木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法，将其应用在观察木本植物根内丛枝菌根生长状态或测定木本植物根内丛枝菌根侵染率中。