[发明专利]检测mRNA样品的加帽效率的产品及用途

说明书

本发明提供一种利用飞行时间质谱技术快速检测mRNA加帽效率的检测试剂盒，特别是检测mRNA及其核酸疫苗的体外合成质量。本发明的检测试剂盒包括提供未加帽mRNA和加帽mRNA的mRNA的标准样品和校正内标，使用飞行时间质谱技术从而对mRNA的加帽效率进行相对定量。本发明首次提出利用飞行时间质谱技术实现对mRNA加帽效率进行检测的方法，操作快速简便，又可通过质谱技术检测微量样本，具有较高的检测灵敏度。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，涉及一种利用飞行时间质谱技术快速检测mRNA加帽效率的产品及用途。

背景技术

细胞信使RNA(mRNA)的加工修饰包括：5'端形成帽子结构，3'端加PolyA，剪接除去内含子和甲基化。

成熟的真核生物mRNA的5'端有m⁷GPPPN结构，称为甲基鸟苷帽子。它是在RNA三磷酸酶，mRNA鸟苷酰转移酶，mRNA(鸟嘌呤-7)甲基转移酶和mRNA(核苷-2')甲基转移酶催化形成的。

不同的甲基可形成3种帽子类型：0、1、2。鸟苷以5'-5'三磷酸键与RNA的5'端相连。当G第7位C被甲基化形成m⁷GPPPN时，此帽子结构称为“帽子0”。存在于单细胞生物。如果RNA第1位核苷酸的2'-O位也甲基化，形成m⁷GPPPNm，称为“帽子1”，普遍存在。如果RNA的第1、2位核苷酸的2'-O位均甲基化(2位必须是A)，形成m⁷GPPPNmNm，称为“帽子2”，次结构发生很少。真核生物帽子的复杂程度与生物进化程度密切相关。

mRNA5'端帽子结构是翻译起始所必须的，为核糖体识别mRNA提供了信号，并协助核糖体与mRNA结合，使翻译从AUG开始。帽子结构可增加mRNA的稳定性，保护mRNA免遭5'-3'核酸外切酶的攻击。

2020年，新冠疫情的爆发点燃了药企对于RNA赛道的热情。随着国产新冠灭活、腺病毒及重组蛋白疫苗相继获批，mRNA疫苗的进度成为人们关注的焦点。与此同时，后疫情时代的到来也让人们对于RNA疗法的未来充满无限遐想。

mRNA疗法正成为用于治疗多种疾病的日益重要的方法。有效的mRNA疗法需要将mRNA有效递送至患者以及在患者体内有效生成由该mRNA编码的蛋白。为了优化mRNA的传递和体内蛋白的生成，通常在构建体的5'端需要适当的加帽，其可以防止mRNA的降解并促进mRNA的翻译，因此，加帽效率的准确性对于确定mRNA治疗应用的质量是特别重要的。

目前常用的加帽效率检测方法有LC-MS法。LC-MS法检测需要做酶切，操作繁琐。难以在临床应用领域进行推广。因此，临床应用领域迫切需要建立一种快速、准确、灵敏的mRNA加帽效率检测方法，为确定mRNA治疗应用的质量、mRNA疫苗的质量研究提供充足的依据。

中国专利申请CN201480010108.7“信使RNA加帽效率的定量评估”公开了一种利用ELISA测定mRNA加帽的方法。包括：体外合成mRNA，提供含有加帽RNA和未加帽RNA的样品。由于该方法使用常规的处理，尽管其在一定程度上能表征该RNA的特征图谱，但由于其待测物中含有其它能被离子化的分子，其得到的图谱实质上是上述各种分子的图谱集合，因此既需要处理和比对的图谱信息量过大，并且因待检分子过于庞大而导致其图谱特征性偏低，只适用于某具体物质而无法推广到其他大量的物质检测中。

中国专利申请CN201980073219“信使RNA纯化的方法和组合物”公开了用于纯化mRNA的方法，其涉及通过在包含变性盐与还原剂组合的缓冲液中沉淀体外转录过程(IVT)合成的mRNA，然后捕获沉淀的mRNA以及将捕获的mRNA溶解在溶液中以获得纯化的mRNA，从通过大规模IVT合成的信使RNA制备物中去除杂质。其中，通过HPLC/MS方法测定最终纯化的mRNA产物的帽子种类。然而，该方法需要结合银染凝胶图像法、CE电泳法进行比较分析，整个过程比较繁琐且耗时耗力。