[发明专利]一种用于检测HLA-B*5101等位基因的引物组及试剂盒

说明书

本发明提供了一种用于检测HLA‑B*5101等位基因的PCR扩增引物组和Taqman探针,包含三对根据HLA‑B*5101特异性序列设计的引物及相应三条探针，还包含一对用于筛除HLA‑B*5101假阳性的引物及相应一条探针，还包含一对内对照引物及相应一条探针。本发明具有如下技术效果：通过三个反应管确定实验样本HLA‑B*5101基因阳性与否，通过一个反应管排除HLA‑B*5101基因的假阳性结果，通过每个反应孔添加的内对照引物及探针排除样本HLA‑B*5101基因的假阴性结果。

技术领域

本发明涉及用于检测HLA-B*5101等位基因的方法和试剂盒，属于生物医学临床分子检测领域。

背景技术

人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)位于人类6号染色体短臂的21.31区，约含360万个碱基对，是目前已知的人类染色体中基因密度最高、多态性最丰富的区域，分为HLA-Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类基因。经典的HLA-Ⅰ类基因包括HLA-A、HLA-B和HLA-C三类，经典的Ⅱ类基因一般指DR、DP和DQ，HLA-Ⅲ类基因与前两类不同，除包含肿瘤坏死因子(TumourNecrosis Factor，TNF)基因、淋巴毒素α(lymphotoxin alpha，LTA)基因、热休克蛋白基因等具有免疫相关功能的基因外，还包括许多非免疫相关基因。其中，HLA-B是人类基因组中最具多态性的区域，包含超过1600个等位基因。研究报道，HLA与多种疾病密切相关，如强直性脊柱炎、贝赛特氏症、乳糜泻等。

白塞病(Behcet’s thsease，BD)是一种病因未明的多系统受累的慢性炎性疾病，现多倾向为一种自身免疫性疾病，即BD患者首先具有一定的遗传易感性，在病原体感染后继发机体免疫功能失调而引发本病。许多研究认为BD与HLA-B51抗原间存在极强的相关性，这些结果提示，BD患者存在着某种易感基因，这种易感基因可能就是HLA-B51，并可能是BD易感的遗传标志。HLA-B51与BD具有强相关性提示，HLA-B51基因特别是等位基因HLA-B*5101是BD的一种标志，但尚不能证明HLA-B*5101本身直接地导致了BD。基于以上资料，推测HLA-B51分子可能触发了BD的发生，因为某些引起BD的外源性因子的抗原与HLA-B51抗原之间具有高度的亲和性。由此可见，HLA-B*5101的检测在白塞病的诊断中有着重要意义。

由此可见，快速而准确地检测HLA*B5101等位基因对临床诊断、疾病鉴别及医学研究具有重要意义。目前国内市场上常用的上述基因检测方法主要有PCR-SSP法、PCR-SSOP法、SYBR Green I及Taqman荧光定量PCR法等。PCR-SSP(sequence specific primer)即序列特异引物引导的PCR反应，是目前被广泛采用的检测方法，其基本方法是设计一系列等位基因型特异性引物，通过特定PCR反应体系扩增各等位基因型特异性DNA片段，产生相对应的特异性扩增产物条带，并用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，此方法成本低，但操作复杂，无法自动获取结果，准确度也有待提高。PCR-SSOP即多聚酶链反应寡聚核苷酸探针杂交，先采用位点特异性引物对HLA-B位点进行扩增，扩增产物包括HLA-B位点的所有等位基因序列，再根据碱基互补原则，将PCR产物经化学变性解链后，单链与固化在2条尼龙膜上的序列特异寡核苷酸探针在特定条件下杂交，经洗膜，加入标记有碱性磷酸盐的抗生物蛋白链菌素与生物素及底物反应，对扩增片段进行分析鉴定。SSOP反向杂交法操作繁琐，耗时长，需严格控制实验条件，否则会导致错配，影响结果准确性。荧光定量PCR的基本原理是在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，从而对PCR产物进行实时检测。SYBR GreenⅠ是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其与DNA的结合是非特异性的，此方法虽然操作简便、快速，但缺乏特异性，准确性差。Taqman荧光定量PCR法克服了以上不足，操作简便、快速，特异性高，并可实现高通量检测。一般来讲，Taqman荧光定量PCR法通过设计一对或多对HLA-B*5101特异性引物及相应探针，进行PCR扩增，考虑到HLA多态性非常高，结果易出现假阳性，从而影响其准确性。因此，本领域急需一种操作简便、快速，且准确度高的检测方法。