[发明专利]一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌，其是将具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstR基因序列的目的片段克隆到表达载体中，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中制备获得。本发明公开了该表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌的应用。本发明还公开了一种微生物酶法拆分制备(R)‑6‑氟‑色满‑2‑羧酸的方法，其是以所述的表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌为催化剂，以外消旋6‑氟‑色满‑2‑羧酸甲酯为底物，进行反应，该方法提供了出色的立体选择性。

技术领域

本发明属于医药生物化工技术领域，具体地说，是关于一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌及其拆分制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸的方法。

背景技术

6-氟-色满-2-羧酸是重要医药中间体。化学名称是6-氟-3，4-二氢-2H-1-苯并吡喃-2-甲酸，化学分子式是C₁₀H₉O₃F分子量是196.18，结构式为：

在许多具有生物活性的分子结构中，都能发现6-氟-色满的色满结构单元的存在。譬如，该结构广泛包含在维生素E及许多拮抗β受体的抗高血压药中。光学纯的6-氟-色满-2-羧酸用于新型降血压药物(S,R,R,R)-奈必洛尔的合成。(S,R,R,R)-奈必洛尔是第三代兼有血管扩张作用的心脏高度选择性β1受体阻滞剂，主要用于治疗原发性高血压，能有效地控制高血压和保持左心室功能，并且具有剂量低、副作用少，耐受性好等优点。

6-氟-色满-2-羧酸是制备奈必洛尔的关键中间体，其拆分效率决定制备奈必洛尔合成方法的最终结果。但是关于6-氟-色满-2-羧酸(R)-，(S)-光学异构体拆分方法文献报道较少。迄今为止，化学方法、生物拆分法等是几种拆分有机酸常用的办法。文献曾有报道使用脱氢枞胺拆分外消旋的6-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-2-甲酸，总拆分收率经实验证明约为32％。此化学拆分方法过程较冗长，并且脱氢枞胺手性拆分试剂价格较贵，效率不高。EP2646426报道过利用来源于真菌Ophiostoma novo-ulmi的酯酶拆分外消旋的6-氟-色满-2-羧酸乙酯，分离纯化得到(R)-6-氟-色满-2-羧酸，ee值是90.72％，转化率是50.28％。此类方法操作简便，条件温和。但是立体选择性不高。因此急需找到其他的高活性和高立体选择性的脂肪酶/酯酶。。基于此，开发了脂肪酶拆分制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸的方法。

发明内容

本发明以外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯为底物，利用离体的酯酶EstR或高效表达EstR的重组大肠杆菌的冻干菌体(fdcEstR)作为催化剂，选择性催化(R)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的水解反应，由此制备获得光学纯的(R)-6-氟-色满-2-羧酸，具有转化率高、立体旋转性强。因此本发明的第一个目的是提供一种表达酯酶ESTR的大肠杆菌基因工程菌。本发明的第二个目的是提供一种表达酯酶ESTR的大肠杆菌基因工程菌的应用。本发明的第三个目的是提供一种微生物酶法拆分制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌，其是将具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstR基因序列的目的片段克隆到表达载体中，获得重组质粒，然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中制备获得。

根据本发明，所述表达载体为pET-28a(+)表达载体。

作为本发明的第二个方面，一种表达酯酶ESTR的大肠杆菌基因工程菌的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、提取热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus strain BGSC93A1的基因组DNA；