[发明专利]粪便样本的核酸提取试剂盒、制备方法及提取方法

说明书

本发明提供了一种粪便样本的核酸提取试剂盒、制备方法及提取方法，涉及生物技术领域，试剂盒包括：蛋白酶K、初裂解缓冲液和裂解结合缓冲液；蛋白酶K的浓度范围10‑30mg/mL；初裂解缓冲液包含：pH6.0‑8.550‑200mM Tris‑HCl，0.5‑30％(w/v)SDS，1‑10mM EDTA，pH8.0‑9.0；裂解结合缓冲液包含：50‑200mM Tris‑HCl，1‑15M盐酸胍，1‑10mM EDTA，0.1‑5％TritonX‑100，0.1‑5％Tween‑20，pH7.0‑8.0。试剂盒提取纯化的DNA核酸得率高、纯度好，解决粪便样本提取的DNA保存时间短的问题。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种粪便样本的核酸提取试剂盒、制备方法及提取方法。

背景技术

粪便样本或肠道内容物样本是肠道疾病研究和肠道临床检测的重要样本来源。粪便或肠道内容物中含有大量宿主消化道脱落细胞及游离的核酸，这些脱落细胞中常含有癌变信号，粪便或肠道内容物中脱落细胞及游离核酸的检测由于无创、无痛、且检测特异性高等特征，常用于结直肠癌等消化道疾病的初筛普查，能更好地达到″早发现、早诊断、早治疗″的目的，是最有效最节约成本的降低肠癌(结直肠癌)发病率和死亡率的方法。肠道微生物研究的主要样本也是粪便样本或肠道内容物样本，可以反应人体肠道内微生物的共生状态。

但是，粪便样本成分复杂，样本中食物残渣等杂质较多，并且含有大量蛋白酶、核酸酶及胆盐、胆红素、腐殖质和色素等各种PCR抑制剂，大多数常规分离提纯核酸技术并不能有效地去除抑制剂等物质，因此通过常规方法分离提纯的粪便样本核酸浓度和质量低下，易降解，保存时间短，并且检测抑制剂常常随着DNA分离提纯一起被分离和浓缩，对后续核酸检测造成不利影响，往往造成PCR扩增实验的失败。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种粪便样本的核酸提取试剂盒、制备方法及提取方法，试剂盒操作简便，能配合自动核酸提取设备使用，提取纯化的DNA核酸得率高、纯度好，不含核酸酶及PCR抑制剂，有效解决粪便样本提取的DNA保存时间短的问题，有利于DNA核酸的保存和后续PCR检测。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种粪便样本DNA核酸提取试剂盒，试剂盒主要包括以下组分：蛋白酶K、初裂解缓冲液、裂解结合缓冲液、磁珠悬浮液、第一漂洗液、第二漂洗液和洗脱缓冲液。

[蛋白酶K]

蛋白酶K是切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，切割脂族和芳香族氨基酸的羧基端肽键，将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。蛋白酶K可以降解蛋白质，灭活DNase和RNase等核酸酶。蛋白酶K在pH 4-12.5较广的pH范围内均有活性，作用温度范围为37-60℃，在盐浓度3M盐酸胍或4M尿素中均有活性，在Tween20(5％)和SDS(1％)去污剂存在的条件下也有活性。

蛋白酶K的浓度范围为10-30mg/mL，例如10、15、20、25、30mg/mL。

在一种优选的实施方式中，蛋白酶K的浓度范围为20mg/mL。

[初裂解缓冲液]

初裂解缓冲液包括：离子缓冲物质50-200mM(例如50、100、150、200mM)Tris-HCl(pH6.0-8.5)，表面活性剂0.5％-30％(例如0.5、1、2、5、10、15、20、25、30％)(w/v)SDS、金属离子螯合剂1-10mM(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mM)EDTA，以及余量的水，初裂解缓冲液的pH为8.0-9.0。

在一种优选的实施方式中，初裂解缓冲液中的成分含量为：100mM Tris-HCl，10％(w/v)SDS，8mM EDTA，初裂解缓冲液的pH为8.5。