[发明专利]一种糖酵解通路关键酶在婴幼儿血管瘤中的应用

权利要求书

1.一种糖酵解通路关键酶在婴幼儿血管瘤中的应用，其特征在于，所述糖酵解通路关键酶在婴幼儿血管瘤IH增殖期组织与血管瘤内皮细胞HemEC中高表达，抑制关键酶磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3PFKFB3的活性可抑制HemEC的增殖与迁移，促进凋亡。

2.一种应用如权利要求1所述糖酵解通路关键酶在婴幼儿血管瘤中的应用的糖酵解通路关键酶在IH中作用的鉴定方法，其特征在于，所述糖酵解通路关键酶在IH中作用的鉴定方法包括以下步骤：

免疫组化分析IH增殖期组织与消退期组织中糖酵解关键酶的表达，在细胞水平采用western blot分析在HemEC与脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein EndothelialCell,HUVEC)的表达情况，并应用CCK8、Transwell与Annexin V/PI法检测抑制剂干预PFKFB3表达后的HemEC的增殖、迁移及凋亡能力。

3.如权利要求2所述糖酵解通路关键酶在婴幼儿血管瘤中作用的鉴定方法，其特征在于，所述糖酵解通路关键酶在IH中作用的鉴定方法包括以下步骤：

步骤一，血管瘤增殖期与消退期组织进行免疫组化学处理；

步骤二，分别进行HemEC和HUVEC的分离与培养；

步骤三，进行Westernblot蛋白电泳以及细胞干预处理；

步骤四，分别进行CCK-8以及Transwell检测；进行AnnexinV/PI双染以及数据统计学分析。

4.如权利要求3所述糖酵解通路关键酶在婴幼儿血管瘤中作用的鉴定方法，其特征在于，步骤一中，所述免疫组织化学处理包括：

将手术切除的血管瘤组织标本迅速放入福尔马林中浸泡固定后，经石蜡组织包埋IH瘤体组织，用切片机制成4μm厚的切片，置入62℃烤箱中烤片过夜；第二天进行二甲苯脱蜡：将组织切片置于二甲苯中浸泡15min，更换二甲苯后在重复2次，每次均15min；随后进行梯度乙醇水化：无水乙醇浸泡10min、95％乙醇中浸泡10min以及80％乙醇浸泡10min；脱蜡与水化结束后，PBS洗涤3次，每次5min；随后进行抗原修复：将组织切片放入pH 6.0的枸橼酸中并置入微波炉高热加热2次，每次8min；

抗原修复完成后，继续PBS洗涤，5min/次，重复3次；3％的双氧水室温下封闭15min，PBS洗涤3次，每次5min；加入兔抗人Glut1(葡萄糖转运体1)、HK2(果糖激酶2)、PFKFB3、PFK1(磷酸果糖激酶1)、(丙酮酸激酶2)和LDHA(乳酸脱氢酶A)多克隆抗体，4℃冰箱过夜；第二天室温孵育二抗1h，PBS洗涤3次，每次5min，最后DAB显色2min，苏木精对比染色。

5.如权利要求4所述糖酵解通路关键酶在婴幼儿血管瘤中作用的鉴定方法，其特征在于，所述兔抗人Glut1、HK2、PFKFB3、PFK1、PKM2和LDHA多克隆抗体的体积稀释比例均为1：200。