[发明专利]一种基于pCAG-flox-neo载体的高效稳定的定点整合基因敲入方法

权利要求书

1.一种基于pCAG-flox-neo载体的高效稳定的定点整合基因敲入方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)首先将pCAG-STOP2载体用EcoRI和PACI双酶切；然后将合成的片段Ⅰ：PKGpromoter-neo-polyA-loxP经过EcoRI和PACI酶切后连接至pCAG-STOP2载体；

(2)随后将步骤(1)合成的载体再次经EcoRI酶切后连入片段II：polyA-loxP得到pCAG-flox-neo载体；

(3)最后，将能够被sgRNA识别的猪pH11位点的sgRNA序列GTTCCTGGAAGTTTAGATCA以及PAM序列GGG插入到T3 promoter后，得到最终的基因敲入载体骨架pCAG-floxP-neo-pH11；

(4)将所需要的hKCNH2-T618I及hmuPKD2片段通过PCR扩增，并通过一步克隆的方式将hKCNH2-T618I和hmuPKD2基因插入到pCAG-floxP-neo-pH11载体骨架中，得到pCAG-floxP-neo-pH11-hKCNH2-T618I和pCAG-floxP-neo-pH11-hmuPKD2质粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中pCAG-floxP-neo-pH11-hKCNH2-T618I的具体构建方法为：

S1：首先将构建好的pCAG-floxP-neo-pH11载体用NotI单酶切，得到线性化的pCAG-floxP-neo-pH11载体；

S2：随后设计带有NotI酶切位点的hKCNH2引物对含有hKCNH2-T618I质粒进行PCR，得到带有NotI酶切位点的hKCNH2-T618I线性化片段；

S3：最后将上两步中得到的线性化片段通过一步克隆方法得到实验所用pCAG-floxP-neo-pH11-hKCNH2-T618I质粒。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)pCAG-floxP-neo-pH11-hmuPKD2的具体构建方法为：

R1：首先将构建好的pCAG-floxP-neo-pH11载体用NotI单酶切，得到线性化的pCAG-floxP-neo-pH11载体；

R2：随后将pCAG-hPKD2-3XFLAG质粒利用点突变试剂盒在hPKD2 cDNA1532位引入突变，成为hPKD2c.A1532T/p.D511V；

R3：接着设计带有NotI酶切位点的引物扩增PKD2起始密码子到3XFLAG终止密码子的序列，得到带有NotI酶切位点的hmuPKD2线性化片段；

R4：最后将R1和R3两步中得到的线性化片段通过一步克隆方法得到实验所用pCAG-floxP-neo-pH11-hmuPKD2质粒。