[发明专利]一种基于蛋白酶控制释放比色检测藻类碱性磷酸酶的纸基器件与应用

权利要求书

1.一种基于蛋白酶控制释放比色检测藻类碱性磷酸酶的纸基器件，其特征在于：所述纸基器件由包括反应区Z1区和检测区Z2区的两层纸芯片构成，所述反应区Z1区封闭处理后，负载了由焦磷酸镁与DNA骨架组成的三维功能脱氧核糖核酸，所述三维功能核酸包裹蛋白酶，所述检测区Z2区负载了3,3',5,5'-四甲基联苯胺。

2.根据权利要求1所述的纸基器件，其特征在于：所述纸基器件包括反应区器件和检测区器件，所述反应区器件上设有反应区Z1区，所述检测区器件上设有检测区Z2区，将反应区器件和检测区器件在竖直方向上重叠后，所述反应区Z1区与检测区Z2区在竖直方向上相对应，所述反应区Z1区和检测区Z2区均为亲水区，所述反应区器件上除了反应区Z1区以外的部分以及检测区器件上除了检测区Z2区以外的部分均为疏水区。

3.根据权利要求2所述的纸基器件，其特征在于：所述反应区Z1区的材质包括NC；检测区Z2区的材质包括FF120HP；所述反应区Z1区的面积≤检测区Z2区的面积。

4.根据权利要求1所述的纸基器件，其特征在于：所述蛋白酶包括辣根过氧化物酶HRP。

5.根据权利要求1所述的纸基器件，其特征在于：包裹了蛋白酶的三维功能脱氧核糖核酸的制备方法，包括以下步骤：

a)SEQ ID NO.1所示的线性DNA模板环状化，得到环状DNA模板，纯化环状DNA模板，并将纯化的环状DNA模板溶于无酶无菌水中；

b)、向反应容器中添加环状DNA模板、SEQ ID NO.2所示的环状DNA模板引物、Phi 29DNA聚合酶缓冲液、蛋白酶、dNTP Mixture、水，于室温下进行涡旋和离心混合均匀，最后向体系中加入Phi 29DNA聚合酶并吸打混匀，25-30℃反应25-45min，65-70℃反应5-10min终止滚环扩增反应，室温放置10-13h，离心，使用无酶无菌水重悬沉淀，所得沉淀物即为包裹了蛋白酶的三维功能脱氧核糖核酸。

6.一种基于蛋白酶控制释放比色检测藻类碱性磷酸酶的纸基器件在制备生物传感器中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：利用纸基器件的反应区Z1区上碱性磷酸酶水解三维功能脱氧核糖核酸上焦磷酸镁为可溶性磷酸盐的变化，以释放被包裹的蛋白酶，蛋白酶在毛细作用力以及重力的双重作用下进入检测区Z2区，并在检测区Z2区上进行催化显色反应，进而实现碱性磷酸酶的检测。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述应用包括如下步骤：

(1)设计形状为两个圆形区域上下重叠在一起的纸基器件，两个圆形区域分别为反应区Z1区和检测区Z2区；圆形周围区域使用固体蜡打印机打印，得到微流控纸基器件；

(2)将打印好的反应区器件浸泡于封闭缓冲液中，封闭一段时间后室温烘干，将包裹了蛋白酶的三维功能脱氧核糖核酸打印到封闭后的反应区Z1区上，制成生物活性纸；将3,3',5,5'-四甲基联苯胺滴加到检测区Z2区，室温干燥，储存于室温；

(3)将反应区Z1区和检测区Z2区重叠在一起，反应区Z1区位于上层，并将含待测物质的缓冲液滴加于反应区Z1区，孵育后，反应区Z1区的溶液经纸基器件的毛细作用力和重力的双重作用下，逐渐向检测区Z2区下渗，下渗完全后将上层反应区Z1区去掉，再将底物显色液A、底物显色液B和HOAc-NaOAc缓冲液的混合溶液滴加于下层检测区Z2区的中心，一段时间后拍照，使用ImageJ软件进行分析。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：步骤(1)中使用固体蜡打印机打印，得到纸芯片器件后，于115-120℃加热2-3min。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述步骤(2)中封闭缓冲液为含质量分数为2％-4％BSA的PBS缓冲溶液，封闭时间为10～20min；添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺的浓度为15～20μM；所述步骤(3)中底物显色液A为3,3',5,5'-四甲基联苯胺的二甲基亚砜溶液；底物显色液B为H₂O₂；HOAc-NaOAc缓冲液为NaOAc和HOAc的混合溶液，将底物显色液A、底物显色液B和HOAc-NaOAc缓冲液的混合溶液滴加于检测区Z2区后，1-2min后拍照。