[发明专利]一种液质联用测定血浆中匹伐他汀浓度的方法

说明书

本发明公开了液质联用测定血浆中匹伐他汀浓度的方法，血浆样品以EDTA‑K₂为抗凝剂，以匹伐他汀‑d4为内标；在96孔板的孔中加入100μL样品，加入50μL浓度为20.000ng/mL的内标匹伐他汀‑d4工作溶液，混匀后加入400μL乙腈，混匀，样品在4℃，2623g离心；取离心后上清液150μL至另一96孔收集板中，加入150μL50％乙腈(含0.005％乙酸)，混匀；样品离心，得测试样品；室温黄光条件下，取5μL测试样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测样品中的匹伐他汀和内标匹伐他汀‑d4的色谱峰，并据此计算血浆样品中的匹伐他汀浓度；本发明的LC‑MS/MS检测方法，以氘代匹伐他汀为内标，加入沉淀剂进行蛋白沉淀，取上清液加稀释剂，预处理后，经高效液相色谱‑串联质谱检测其浓度，检测速度快，精度高，灵敏度好。

技术领域

本发明属于医药技术领域，更具体的说涉及一种液质联用测定血浆中匹伐他汀浓度的方法。

背景技术

匹伐他汀(Pitavastatin,PIT)对羟甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶有强力拮抗抑制作用，能够高效抑制人肝细胞HepG2中生成胆固醇的过程，从而阻碍胆固醇的合成。匹伐他汀能在超低浓度下诱导低密度脂蛋白(LDL)受体mRNA的合成，使其数量增加，导致LDL受体密度增大，从而促进LDL的清除，使血浆LDL浓度及血浆总甘油三酯浓度降低，有效治疗高胆固醇血症。匹伐他汀结构中含有羟基羧酸结构，在体内体外均能缩水成环形成匹伐他汀内脂结构。由于匹伐他汀和匹伐他汀内脂在体内外易于互相转化，故对于匹伐他汀血药浓度的准确测定产生影响。为了减弱两者在血样采集、储存和样品预处理过程中产生的羟基羧酸型与内脂型结构的相互转化，要求在血样在采集储存及预处理等过程中操作简单快速易于控制，如控制PH值和控制温度等。

目前现有技术检测人血浆中的匹伐他汀的分析方法主要为固相萃取和液液萃取法，多采用非同位素内标，无法保证待测物与内标洗脱方式的一致性，且未评估羟基羧酸和内脂的相互转换，有成本高，耗时长，操作过程难控制等缺点。为满足临床生物样品分析的需求，需开发更简单、可靠、省时的人血浆中匹伐他汀浓度测定的方法，本发明建立了一种快速、灵敏度高、条件可控的高效液相串联质谱法测定人血浆中匹伐他汀浓度的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种液质联用测定血浆中匹伐他汀浓度的方法，人血浆样品以氘代匹伐他汀为内标，加入沉淀剂进行蛋白沉淀，取上清液加稀释剂，预处理后，经高效液相色谱-串联质谱检测其浓度，检测速度快，精度高，灵敏度好。

本发明技术方案一种液质联用测定血浆中匹伐他汀浓度的方法，人血浆样品经预处理后经高效液相色谱-串联质谱检测其浓度，具体包括以下步骤：

(1)血浆样品预处理：

室温黄光条件下，以EDTA-K₂为抗凝剂，以匹伐他汀-d4为内标；在96孔板的孔中加入100μL样品，加入50μL浓度为20.000ng/mL的内标匹伐他汀-d4工作溶液，混匀后每一个样品孔中加入400μL乙腈，封板，混匀5min，样品在4℃，2623g离心10min；取离心后上清液150μL至另一96孔收集板中，加入150μL含有50％乙腈和0.005％乙酸的溶液，封板，混匀；样品在4℃，2623g离心10min，获得测试样品，待进样；

(2)试样测定：

室温黄光条件下，取5μL测试样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测样品中的匹伐他汀和内标匹伐他汀-d4的色谱峰，并据此计算人血浆样品中的匹伐他汀浓度。

优选地，步骤(2)中：液相色谱条件为：