[发明专利]一种特异性检测非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株的LAMP引物组合及应用

说明书

本发明属于ASFV核酸检测领域，公开了一种特异性检测非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株的LAMP引物组合及应用。本发明所提供的LAMP引物可以很好的区分非洲猪瘟病毒流行株与基因缺失株，且具有灵敏度高、特异性好的特点，同时该方法中的保守基因B646L基因的引物可以检测中国现阶段流行的所有基因型的毒株，B646L基因、EP402R基因和MGF_360‑14L基因的最低检测限可达1 copies/μL。本方法简单快速高效，一小时左右即可完成检测。

技术领域

本发明属于ASFV核酸检测领域，具体涉及到一种特异性检测非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株的LAMP引物组合及应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，简称ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(Africanswine fever virus，ASFV)引起的临床表现为高热、出血、呼吸困难、内脏器官广泛性出血的高度接触性传染性疾病，主要在家猪和野猪之间传播，也可通过软蜱传播，其特点是病程快、传播广、死亡率高。

2020年5月，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所报道了一株人工缺失基因的非洲猪瘟弱毒活疫苗对家猪具有良好的安全性和有效性。该研究团队还证明，该疫苗完全具备大规模生产条件。该疫苗是目前最具实现产业化应用前景的疫苗，将为我国及有关国家非洲猪瘟疫情的有效防控提供重要技术手段。由于市面上对ASFV的检测大多是对保守基因B646L进行检测，加之该疫苗为弱毒活疫苗，因此该疫苗的使用会导致常规方法检测结果为阳性，无法确定是接种了疫苗导致的阳性还是感染了野毒导致的阳性，因此需要对它们进行区分。

B646L基因(p72)是包括野生型和基因缺失型株在内的所有ASFV的保守区域，选择该基因作为靶基因以区分ASFV与其他病毒。申请CN110551695A提供了一种非洲猪瘟病毒基因缺失弱毒株，该弱毒株是缺失以下基因的功能蛋白：CD2v基因编码产物EP402R基因和三个多基因家族区段(MGF-360-12L、MGF-360-13L、MGF-360-14L)编码产物；中国专利CN110093324B公开了一种基因II型的非洲猪瘟病毒MGF-360-505R缺失和CD2v与MGF-360-505R联合缺失的基因缺失病毒。因此以B646L基因(p72)、MGF多基因家族区段(MGF-360-12L、MGF-360-13L、MGF-360-14L)和EP402R(CD2v)作为靶标，可以确定猪是感染了野生型ASFV还是基因缺失株。

关于非洲猪瘟病毒的检测，国内外研究人员建立了多种核酸检测方法，主要分为病原学检测和血清学检测。目前，已经报道的区分野生型和基因缺失型的检测方法大多是荧光定量PCR，该方法灵敏度虽好但是探针的合成价格昂贵，而且需要使用专业的荧光定量PCR仪器进行检测，各仪器之间性能差异大，实验结果的分析需要专业的培训。因此，本研究通过建立非洲猪瘟的环介导等温检测方法，研制出一种高效快速区分非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株的方法，解决基层猪场非洲猪瘟检测成本高、操作复杂的问题。利用本发明提供的引物，比CN110885905A中公布的引物具有更强的灵敏性。