[发明专利]从胎盘组织中扩增自然杀伤细胞的方法

权利要求书

1.培养自然杀伤细胞的方法，其包括如下步骤：

A：胎盘血的获取

1)、胎盘清洗：使用手术镊将胎盘组织50g取出，放入不锈钢托盘中，用少量含青霉素-链霉素-两性霉素的组织清洗液对胎盘表面进行冲洗，去除表面上的凝血污渍；所用的组织清洗液是通过如下方式配制所得溶液：用0.9%氯化钠注射液配制成含青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL和0.25µg/mL两性霉素B的溶液，过滤除菌，即得；

2)、用剪刀、镊子钝性剥离并丢弃胎盘表面的羊膜层，剪去其上的脐带组织；然后用剪刀将剩余的胎盘小叶组织剪成3~7cm³的小块，取一300目不锈钢过滤网放置在不锈钢杯上，将小块胎盘小叶组织放在300目不锈钢过滤网上，用勺子挤压全部的胎盘小叶组织，以挤出其内的胎盘血流入至不锈钢杯内，收集胎盘血；

B：胎盘小叶组织的消化

1)、组织消化液的配置：

①向I型胶原酶粉末中添加PBS，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/mL的I型胶原酶溶液；所用的PBS是PH6.8的磷酸盐缓冲液，其制法是：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250mL，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118mL，用水稀释至1000mL，摇匀，即得；

②向II型胶原酶粉末中添加HBSS缓冲液，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/mL的II型胶原酶溶液；所用的HBSS缓冲液是通过如下方式配制所得溶液：将8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.1g的MgSO₄·7H₂O、0.1g的MgCl₂·6H₂O、0.06g的Na₂HPO₄·2H₂O、0.06g的KH₂PO₄、1.0g的葡萄糖、0.14g的CaCl₂、0.35g的NaHCO₃加蒸馏水至1000mL溶解并调pH至7.4，过滤除菌，摇匀，即得；

③向DNA酶中添加HBSS缓冲液，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/mL的DNA酶溶液；

④向嗜热菌蛋白酶粉末中添加缓冲液，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/mL的蛋白酶溶液；

⑤将以上所得I型胶原酶溶液、II型胶原酶溶液、DNA酶溶液、蛋白酶溶液按5：5：7：5的比例进行混合，配置成为组织消化液；

2)、在250mL离心杯中添加25～30mL的HBSS缓冲液，将挤压完胎盘血的胎盘小叶组织小块放入离心杯中，用剪子将小叶组织进一步剪碎成0.5～1mm³，然后转移至300目筛网上，用HBSS缓冲液进行过滤，并使用HBSS缓冲液再清洗两次，清洗至滤液清澈；将清洗后的组织加入已预热至37℃的组织消化液100mL中，充分混匀，用封口膜封口后，于37℃、100rpm摇床中振荡消化30min；

3)、消化结束后，将装组织消化液的离心杯放入安全柜，倒入组织清洗液，使用300目滤网过滤；再用400mL组织清洗液多次洗涤组织，收集滤清液；将滤清液倾倒入若干250mL离心杯中，放入离心机，进行1500rpm、8min、25℃离心；离心结束后，弃上清液，再次用组织清洗液重悬细胞沉淀，充分混匀后再次以1500rpm、8min、25℃离心；

4)、离心结束后，弃上清，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞悬液，至50mL离心管中，以1800rpm、10min、25℃离心，离心结束后弃上清液，收集细胞沉淀，用PBS重悬，得到胎盘小叶组织细胞悬液；

C：利用X-lab®自动化分离设备提取胎盘血及胎盘细胞悬液中的单个核细胞

1)、将步骤A所得胎盘血和步骤B所得胎盘小叶组织细胞悬液混匀，用无菌注射器抽取混合液注入到含抗凝剂3.2%枸橼酸钠溶液的200mL采血袋内，抗凝剂与生物样本的体积比为1：12，混匀后放置于摇摆器上慢速摇摆15min；

2)、将X-lab®自动化分离设备的一次性使用分离杯的塑料针头插入到采血袋上的无菌接口内，将采血袋挂起，使其中的血液自然流入分离杯内的中央舱室；用无菌接合仪焊接管路将血液采集袋与一次性分离杯分离；

3)、将一次性分离杯配平后放置于市售的可编程的离心机中进行离心操作，离心程序参数如下：

，

执行上述离心操作后从一次性分离杯的回收舱室获得细胞浓缩层，用NK细胞完全培养基将该细胞浓缩层稀释并调整细胞密度，得到胎盘MNC细胞悬液；

D：胎盘来源的单个核细胞扩增NK细胞

1)、将步骤C所得胎盘MNC细胞悬液用NK细胞完全培养基调整细胞密度为1×10⁶/mL，接种至T75培养瓶中，每瓶添加的细胞悬液20mL，然后向培养瓶中添加IL-15 50ng/mL、FLT3-L10ng/mL、OK432 10ng/mL、硝酸亚铁7µg/mL和苏氨酸60µg/mL，混匀后将培养瓶置于37℃、5%CO₂培养箱中培养；

2)、每48h向培养瓶中补加IL-15 50ng/mL、FLT3-L 10ng/mL、OK432 10ng/mL、硝酸亚铁7µg/mL和苏氨酸60µg/mL，每48～72h向培养瓶中补加NK细胞完全培养基，并调整细胞密度为(0.5～1.5)×10⁶/mL，当培养的细胞悬液总体积达到200mL时，将细胞悬液转移至G-rex培养瓶中继续培养至14天；

3)、培养结束后，将细胞悬液吸出至250mL离心瓶中，1500rpm、8min、25℃离心；结束后弃上清液，用PBS重悬细胞沉淀，调整细胞密度为1×10⁶/mL，得到自然杀伤细胞。

2.根据权利要求1的方法，所述NK细胞完全培养基是以X-vivo 15培养基作为基础培养基，在其中增补添加2.5%血清替代物、1mM酪氨酸、2mM的L-谷氨酰胺。