[发明专利]pAdM3C感染大鼠胰腺导管细胞促进转分化方法

说明书

本发明提供pAd‑M3C感染大鼠胰腺导管细胞促进转分化方法。使用Biocoll分离液通过密度梯度离心分离胰岛能尽可能多的去除胰岛细胞团，使细胞得到初步分离纯化，取用去除了胰岛细胞团的管底细胞，则降低了胰岛细胞的影响；管底细胞经过40μm小过滤器筛选，进一步去除大的胰岛细胞，在培养不同时间段换用培养基a、b、c，且c中的成分烟酰胺、KGF、EGF比例和作用有利于导管细胞的成长，所获得的细胞数量和纯度都有提高；利用腺病毒（pAd‑M3C）感染胰腺导管细胞，其中加样体积经过感染力实验得到验证，使胰腺导管细胞的感染率高达80%以上，有利于后续的转分化实验。

技术领域

本发明属于分子生物学细胞免疫技术领域。具体涉及pAdM3C感染大鼠胰腺导管细胞促进转分化方法。

背景技术

大鼠胰腺导管细胞的分离纯化培养，目前国内研究者多采用消化酶对胰腺组织直接消化分离，通过利用促进上皮细胞生长的培养基对原代细胞进行筛选培养，存活下来的细胞则认为是含有胰腺导管细胞的细胞群。胰腺导管细胞因为获取困难，培养不易，鉴定复杂，故研究的课题组较少，目前较常用的消化酶直接消化法获得的原代细胞，一方面，细胞获得率太低，另一方面细胞纯度不够，有很多成纤维细胞、腺泡细胞、胰岛细胞等混杂。目前国内未见采用腺病毒对胰腺导管细胞进行转分化的报道。

发明内容

本发明的目的在于，针对上述问题，提供pAd-M3C感染大鼠胰腺导管细胞促进转分化方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种胰腺导管细胞分离培养基，包括培养基a、培养基b和培养基c，其中，

培养基a为含10vol%FBS的CMRL1066培养基；

培养基b为含0.02vol%大豆胰酶抑制剂、10vol%FBS、100μg /ml Pen Strep的CMRL1066培养基；

培养基c为含20 ng /ml EGF、10 ng /ml KGF、10 mM烟酰胺、25 mM Glucose、100μg /ml Pen Strep、10vol%FBS的DMEM / F12培养基。

一种密度梯度离心分离胰岛细胞的分离液，包括分离液A、分离液B和分离液C，其中，

分离液A由Biocoll分离液与Hanks液按体积比为20:1的比例混合配制而成，密度为1.096 g/ml；

分离液B由分离液A与Hanks液按体积比为6.4 : 1.1的比例混合配制而成，密度为1.085g/ml；

分离液C由分离液B与Hanks液按体积比为2.4: 2.6的比例混合配制而成，密度为1.051g/ml。

pAd-M3C感染大鼠胰腺导管细胞促进转分化方法，包括以下步骤：

（1）使用Biocoll分离液通过密度梯度离心分离胰岛细胞：利用密度梯度离心分离胰岛细胞的分离液分离胰岛细胞；

（2）胰腺导管细胞分离；利用胰腺导管细胞分离培养基分离胰腺导管细胞；

（3）利用腺病毒pAd-M3C进行转分化诱导：腺病毒pAd-M3C感染步骤（2）分离的胰腺导管细胞。

上述步骤（1）包括以下具体步骤：

1）加分离液A液于胰岛中，轻轻混匀，小心勿起气泡；

2）再沿离心管壁缓慢依次加入分离液A、分离液B和分离液C，三种分离液的体积比为1:1:1，小心保持界面，轻拿轻放；

3）4℃离心，400 rpm，3 min后稳定加速至1700 rpm，14 min，无刹车减速；

4）用玻璃吸管吸取交界面细胞团入新的15ml离心管中，加入4℃预冷的洗液至10ml，1000 rpm，1 min，4℃离心，弃上清，重复洗涤3次，获得移除胰岛细胞后，含有腺泡和导管细胞的沉淀；

5）洗涤后的细胞沉淀用2 ml洗液重悬置于培养皿中；