[发明专利]一种获得四倍体艾纳香不定芽的方法

说明书

本发明公开了一种获得四倍体艾纳香不定芽的方法，即选用二倍体艾纳香的根切段作为外植体，以含有0.025～0.1mg/L NAA、1.0～2.0mg/L 6‑BA和90～150mg/L秋水仙素的加倍培养基进行培养，诱导外植体细胞同时进行染色体加倍和分化不定芽。本发明填补了艾纳香根作为外植体的空白，增加了艾纳香在扩繁增殖和生物技术育种过程中有效外植体来源。更重要的是，本发明使艾纳香的根细胞直接在染色体加倍的同时分化形成不定芽，不必经过形成愈伤组织的过程，由此简化了技术环节，减少了再生芽的变异和嵌合体的产生；本发明应用于艾纳香多倍体育种，将可显著节省时间和人力成本，提高工作效率。

技术领域

本发明属于植物多倍体育种技术领域，具体涉及一种获得四倍体艾纳香不定芽的方法。

背景技术

艾纳香(Blumea balsamifera(L.)DC.)是菊科艾纳香属多年生草本植物，分布于我国云南、贵州、海南、中国台湾等地，是中药艾片(左旋龙脑)的唯一来源植物，其提取物是多种中成药的主要原料，并广泛应用于食品、药妆等市场领域，具有良好的市场前景。

长期以来，艾纳香种植技术相对落后，良种种苗扩繁是主要难点。艾纳香在生产上以种子繁殖和分根繁殖为主，种子繁殖属于有性繁殖，缺点在于出苗率低，且后代性状分离，无法保持原有种性。分根繁殖属于无性繁殖，缺点在于无法排除原有植株的病原体，且效率低下。因此，有必要开展艾纳香种苗的离体扩繁研究。艾纳香作为药用植物，其药效成分左旋龙脑属于其次生代谢物，多倍体育种有利于促进其次生代谢物包括左旋龙脑的积累，因此多倍体育种是艾纳香生物技术育种的重要方向。

前人对艾纳香染色体加倍技术进行多尝试，主要是基于诱导腋芽染色体加倍。但是，该技术存在根本性的缺陷。诱导腋芽增殖是最常用的艾纳香种苗快繁技术，其通过刺激植株原有的侧芽生长点生长，达到扩繁的目的，不涉及细胞脱分化过程。如果试图用此方式进行人工诱变或转基因，得到嵌合体的几率会很高，因为，构成原有的芽的复数细胞很难全部变异或得到转化，两种细胞将混杂在一起，从而产生嵌合体。嵌合体在生长过程中，会发生性状不稳定和性状消失的问题，导致育种工作失败。

在现有技术中，处理的是腋芽，即处理的芽是已经存在的、已完成芽分化的腋芽，因此在人工诱导其染色体加倍的过程中，只能作用于正在有丝分裂的细胞，对前期已经完成了有丝分裂的细胞，如果其不继续有丝分裂，就不能刺激其染色体加倍。因此，会造成处理不完全的情况，即不能使整个处理对象的所有细胞完全加倍，所获得的芽体中既有加倍的四倍体细胞，又有未加倍的二倍体细胞的情况，即嵌合体。嵌合体植株在成长和繁殖过程中，很容易因为多倍体细胞和二倍体细胞生长发育趋势差异而出现多倍体植株退化成二倍体植株的情况，因此，现有技术难以满足目前艾纳香的育种需求。

另一种可能尝试的技术，是使用叶片外植体，先使用一种培养基诱导产生二倍体愈伤组织，然后人工诱导技术，诱导二倍体愈伤组织细胞加倍为四倍体愈伤组织，再转移到另一种培养基，诱导四倍体愈伤组织分化形成四倍体不定芽。目前尚未有文件报道这种技术在艾纳香多倍体育种方面的成功应用。通常，人工诱变在愈伤组织阶段进行，但由于部分未成功诱变的细胞同样可能分化形成不定芽，因此该过程同样存在嵌合体的问题。此外，这种技术需要经过三个步骤，配制至少三种培养基，接种至少三次，培养至少三个阶段，因此不仅过程繁琐，而且还存在一定几率、偶发于愈伤组织阶段的非目的性变异，干扰诱变或遗传转化结果。

鉴于此，目前仍缺乏一种不会产生嵌合体或嵌合体率较低，且过程简便的获得四倍体艾纳香不定芽的组织培养方法。

发明内容