[发明专利]用于扩增微生物醇脱氢酶基因片段的简并引物及所述简并引物的应用

说明书

本发明提供用于扩增微生物醇脱氢酶基因片段的简并引物，还提供一种利用简并引物扩增微生物醇脱氢酶基因片段的检测方法，首先提取待测样品微生物总DNA作为模板，用简并引物进行PCR扩增，纯化后进行高通量测序，通过获取测序结果是否含有醇脱氢酶和GroES‑like蛋白的操作分类单元判断待测样品微生物中是否含有醇脱氢酶。本发明从醇脱氢酶氨基酸的结构域出发，设计出用于扩增微生物醇脱氢酶基因片段的简并引物，并应用于检测以确定醇脱氢酶基因，进而确定检测样品中含潜在产高级醇微生物种类及丰度大小，从而为样品中潜在产高级醇微生物组成的进一步研究奠定基础。

【技术领域】

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种用于扩增微生物醇 脱氢酶基因片段的简并引物和检测方法，还涉及应用所述引物检测大 曲中潜在产高级醇微生物丰度的方法。

【背景技术】

高级醇(碳原子数大于2的醇类)，具有醇甜和助香功能，同时也 是形成酯类和醛类等风味物质的重要前体，在传统发酵食品风味物质 组成中占有重要地位。但当高级醇含量过高时不仅会导致风味异常， 甚至会造成健康风险。

确定多种微生物参与的混合微生物发酵过程中，具有高级醇生产 能力的微生物，进而通过配比、选择适合种子(曲)发酵是控制发酵 食品中高级醇含量的有效方法。但是，目前基于微生物多样性的关联 分析方法不能建立高级醇与微生物之间的直接联系。

代谢途径中的功能基因可用作标记基因，不仅可以表征群落代谢 功能，还能进一步研究混合微生物中潜在的代谢产物生产者。根据现 有微生物高级醇代谢途径来看醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase， ADHs)在微生物高级醇代谢过程中非常关键(图1)。通过设计简并 引物扩增菌种(曲)中微生物醇脱氢酶基因片段，利用高通量测序技 术获取序列信息，进一步利用生物信息学技术分析潜在产高级醇微生 物确定菌种配比，保证产品质量。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术在分析潜在产高级醇微生物方面的 空白，提出能够扩增微生物醇脱氢酶基因片段的简并引物，并基于该 简并引物实现潜在产高级醇微生物丰度的检测。

针对上述目的，本发明提供用于扩增微生物醇脱氢酶基因片段的 简并引物，所述引物包括：

L.ADHs-F：5′ATAGAATACTGCGGCgtntgyca3′

L.ADHs-R：5′TTTGTACGCTGTTACnccngcrca3′

基于上述引物，本发明还提供一种利用简并引物扩增微生物醇脱 氢酶基因片段的检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取待测样品微生物总DNA；

(2)以步骤(1)中微生物总DNA为模板，用上述简并引物进 行PCR扩增反应，获得扩增产物A1；

(3)将扩增产物A1纯化获得纯化扩增产物B1；

(4)将纯化扩增产物B1进行高通量测序，通过获取测序结果是 否含有醇脱氢酶和GroES-like蛋白的操作分类单元判断待 测样品微生物中是否含有醇脱氢酶。

在本发明中，所述醇脱氢酶是锌依赖长链醇脱氢酶，是微生物高级 醇代谢途径中的关键酶，负责醇与醛之间的转化。

进一步地，步骤(4)中所述分析并判断结果的方法为：

高用量测序结果经FLASH拼接后，使用Usearch以95％～100％相 似度对测序结果进行操作分类单元(OTU)划分，OTU代表性序列与 Non-redundant protein(nr)数据库进行Basic Local Alignment Search Tool (blastx)比对并注释OTU代表性序列的蛋白信息，注释信息中含有 Alcohol dehydrogenase和GroES-like protein的OTU即为醇脱氢酶基因OTU。