[发明专利]一种稳定表达SLAM蛋白的非洲绿猴肾细胞系及其构建方法和应用

说明书

本发明属于基因重组与蛋白表达技术领域，具体涉及一种稳定表达SLAM蛋白的非洲绿猴肾细胞系及其构建方法和应用，本发明的细胞系为非洲绿猴肾细胞Vero‑E6‑SLAM，于2021年11月11日送往广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCCNo:62054。通过构建pAAVS1‑Donor‑SLAM过表达质粒，再与pCas‑Guide‑AAVS1共转染至Vero‑E6细胞得到。该细胞系可以将外源基因整合入基因组内已知的安全位点，实现转入基因的正常表达而又不影响细胞的正常生理功能，克隆准确度高，可以应用于高产SLAM蛋白，为犬瘟热病毒的分离和致病机制研究提供平台。

技术领域

本发明属于基因重组与蛋白表达技术领域，具体涉及一种稳定表达SLAM蛋白的非洲绿猴肾细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

犬瘟热(Canine distemper，CD)是由副粘病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒(Canine distempervirus，CDV)感染犬所引起的急性、热性及高度接触性的一种烈性传染病。主要临床特征是双相热，眼、鼻、消化道等处粘膜炎症，以及卡他性肺炎、皮炎及神经症状。自1809年首次报道以来，该病呈现了全球范围内流行的趋势，给伴侣动物与野生动物造成了严重影响。

CDV作为一种急性、烈性传染病，因无特效药物治疗，危害巨大。目前已知的CDV宿主已拓展至十几个科属的上百种动物，包括食肉目所有的8个科、偶蹄目猪科、灵长目的猕猴属和鳍足目的海豹科等，有报道显示，CDV也能感染大熊猫、东北虎、雪豹等珍稀濒危动物，使人们对CDV更加重视。信号淋巴细胞激活因子(Signalling lymphocyte activationmolecule,SLAM)是免疫球蛋白超家族的成员之一，在CDV进入宿主及病毒在宿主体内扩散的过程中起着十分重要的作用，与犬瘟热病毒的H、F蛋白相互作用可使病毒进入细胞。

对基因组进行改造在细胞工程上具有极大的价值。其中，Safe harbor基因敲入是在染色体上的特定位点插入目的基因和其他遗传因子，从而实现对基因组的改造。但该基因改造方法取决于转入基因功能的可靠性和可预测性，既要求在转入基因时不扰乱内源基因和/或其他调控因子的功能，还需要克服随机整合转入基因时由于不可预知插入或突变所带来的问题。

因此，为了克服上述问题，亟需一种稳定表达SLAM的细胞株，以实现SLAM稳定高效表达，为犬瘟热病毒的分离和致病机制研究提供平台。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种稳定表达SLAM蛋白的非洲绿猴肾细胞系。该细胞系被鉴定为非洲绿猴肾细胞系Vero-E6-SLAM。

本发明的第二个目的是提供上述稳定表达SLAM蛋白的非洲绿猴肾细胞系的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述稳定表达SLAM蛋白的非洲绿猴肾细胞系的应用。该细胞系可以高产SLAM蛋白，并且为犬瘟热病毒的分离和致病机制研究提供平台。

本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：

一种稳定表达SLAM蛋白的非洲绿猴肾细胞系Vero-E6-SLAM，所述Vero-E6-SLAM细胞于2021年11月11日送往广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCC No:62054。

本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：

上述的稳定表达SLAM蛋白的非洲绿猴肾细胞系Vero-E6-SLAM的制备方法，包括以下步骤：

S1、将目的基因SLAM连接至pAAVS1-Donor载体上，构建得到pAAVS1-Donor-SLAM重组质粒；

S2、将重组质粒pAAVS1-Donor-SLAM和pCas-Guide-AAVS1质粒共转染至非洲绿猴肾细胞Vero-E6中；