[发明专利]荧光素酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及荧光素酶突变体及其应用。本发明提供的荧光素酶突变体为野生型的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述突变体包括L17R、I47R、F176R、E354K突变位点中的至少一个。其在宿主中能够高效表达，且表达产物具有高活性，高热稳定性的特点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及荧光素酶突变体及其应用。

背景技术

北美萤火虫(Photinus pyralis)中提取的荧光素酶相对分子质量60kDa，由2个亚基组成，酶活区域位于大亚基和小亚基之间的疏水口袋。荧光素酶的催化反应过程是：在氧气存在的环境中，由ATP提供能量，荧光素酶在Mg²⁺作为辅因子的条件下催化底物荧光素的氧化，同时将化学能转换为光能。

荧光素酶广泛应用于基因工程，可以追踪目的基因在动植物体内的转录、翻译和表达，以非入侵的形式监控生物学过程，同时还可以用于分析蛋白与蛋白的互作。荧光素-荧光素酶发光体系灵敏度高，发光强度与体系中的ATP含量成正比，可以应用于焦磷酸测序技术中。同时还可以用于微生物检测，在食品卫生监管、环境监测、有毒物质检测和药敏实验中也有广泛的应用价值。随着荧光素酶应用的普及，需求持续增多，研究具有高活性且对温度、pH耐受性良好，成本低廉的荧光素酶具有重要意义。

野生型萤火虫荧光素酶在体外37℃放置3min就会丧失活性。经分析，荧光素酶含有大量疏水氨基酸残基的单一多肽链，二级结构中含有大量的无规则卷曲结构，不利于维持蛋白质的结构稳定。软件预测荧光素酶不含二硫键，而二硫键对蛋白质的结构稳定有重要作用。这些原因可能是导致荧光素酶热稳定性差的原因。因此对荧光素酶的改造在酶的应用上有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供活性高且稳定性良好的荧光素酶突变体及其应用。

本发明提供的萤火虫荧光素酶的突变体的野生型的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述突变体包括L17R、I47R、F176R、E354K突变位点中的至少一个。

本发明所述火虫荧光素酶的突变体是在野生型北美萤火虫荧光素酶的基础上发生的突变。其突变位点的个数为1～4个。所述突变位点包括第17位氨基酸由L突变为R，第47位氨基酸由I突变为R，第176位氨基酸由F突变为R，第354位氨基酸由E突变为K。一些具体实施例中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了编码本发明所述的突变体的核酸。

一些实施例中，所述编码突变体的核酸经密码子优化，其核酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供了一种表达载体，其包括本发明所述的核酸。即本发明提供了包括编码本发明所述突变体核酸的表达载体。

一些实施例中，所述表达载体的骨架载体选自pET系列载体。一些具体实施例中，所述表达载体的骨架载体为pET28a。一些具体实施例中，所述编码突变体的核酸的序列如SEQ ID NO:3所示，其在骨架载体中的插入位点为Nde I和Xho I。

本发明还提供了转化或转染本发明所述表达载体的宿主细胞。

本发明中，所述宿主细胞为原核生物细胞，一些实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌。一些具体实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

本发明还提供了所述的突变体的制备方法，包括：培养所述的宿主细胞，诱导所述突变体的表达。

本发明所述的制备方法中，所述培养的培养基为LB培养基。具体实施例中，所述TB培养基中含有卡那霉素。所述诱导的诱导剂为IPTG，所述IPTG的浓度为1mM。