[发明专利]一种分泌尿酸氧化酶的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及一种分泌尿酸氧化酶的基因工程菌，其为含有内源性编码分泌信号肽的基因和外源性编码尿酸氧化酶(UOX)的基因的重组毕赤酵母菌。该工程菌是采用毕赤酵母菌为宿主细胞，通过导入编码尿酸氧化酶(UOX)的基因或经过密码子优化的编码尿酸氧化酶(UOX)的基因，并通过对分泌途径的优化构建而得，该菌为高效分泌尿酸氧化酶的基因工程菌。本发明还涉及一种分泌尿酸氧化酶的基因工程菌的构建方法。该方法通过对分泌信号肽的筛选以及对尿酸氧化酶过氧化物酶体靶向信号的去除，增强了尿酸氧化酶的分泌表达水平，且操作简易，可应用高产尿酸氧化酶菌株的构建及尿酸氧化酶的工业化制备，具有很好的市场应用前景。

技术领域

本发明属于基因重组技术领域，涉及一种分泌尿酸氧化酶的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

尿酸(又称2,6,8—三氧嘌呤)是人体内嘌呤代谢的最终产物，血尿酸化学式是C5H4N4O3，微溶于水，易形成晶体，如果人体内嘌呤代谢紊乱产生过量尿酸，或者尿酸排泄受阻，就会造成血液中尿酸浓度增高，形成高尿酸血症。此外，尿酸盐易析出并沉积于关节、肾脏、心瓣膜等组织器官处，导致痛风。癌症患者化疗之后，大量肿瘤细胞迅速死亡、溶解，其核内和胞浆内嘌呤代谢产物释放进入血液，可能会导致肿瘤溶解综合症(TLS)，其主要特征为高尿酸血症、高钾血症、高磷血症和低钙血症，严重者会引发急性肾衰竭而导致死亡。

尿酸氧化酶(UOX)可催化尿酸转变为尿囊素，而后者的溶解度比尿酸大5－10倍，从而可以有效缓解高尿酸血症的症状，因此逐步应用于临床。痛风是长期嘌呤代谢障碍，血尿酸浓度增高引起组织损伤的一组异质性疾病。随着人们生活水平的不断提高，饮食中富含嘌呤的成分增加，痛风的发病率有逐渐上升的趋势。治疗痛风的传统药物是别嘌呤醇(Allopurinol)是黄嘌呤氧化酶的竞争性抑制剂，通过抑制黄嘌呤氧化酶活性，阻断尿酸的产生路径，使嘌呤分解的产物以黄嘌呤和次黄嘌呤形式排出，但同时会增加肾脏排泄尿酸前体的负荷；另一方面，产生的另一产物黄嘌呤在尿液中比尿酸更加难溶，使得别嘌呤醇治疗的痛风病人有时会出现黄嘌呤肾病和结石，与别嘌呤醇相比，尿酸氧化酶能很快地降低血液中的尿酸浓度，并使肾脏和关节中的尿酸沉淀很快地被分解，并且其副作用比别嘌呤醇小。

据统计，近10年来我国内地的高尿酸血症发生率为10.1％—13.3％，高尿酸血症患者有年轻化的趋势。目前国内市场上抗高尿酸血症药物品种少，主要包括苯溴马隆、别嘌呤醇、秋水仙碱、丙磺舒等。这些药物有诸多缺陷，有研究证明：UOX是更为安全、有效的替代药物，可快速控制血浆中尿酸的浓度，降低病人在化疗中出现肿瘤溶解的风险。同时UOX副反应少，对病人肾功能损伤较小，因此是一类极具潜力的药物。

1968年，法国Sanofi公司首次通过Aspergillus flavus提取纯化来生产UOX并在部分欧洲国家销售，通过注射给药用于治疗严重的高尿酸血症，但在微生物Aspergillusflavus中直接提取尿酸氧化酶周期长，发酵过程难以控制，产率低，产品纯度不高，在使用中还会有副作用。1992年有人用基因重组的大肠杆菌来尝试对黄曲霉尿酸氧化酶基因进行胞内表达，有酶活，但表达量低，无产业化前景。近些年Sanofi-Synthelabo公司在酿酒酵母中异源表达了Aspergillus flavus来源的重组UOX，通用名为拉布立酶(Rasburicase)，于2001年6月开始在德国和英国销售，2002年7月开始在美国销售，用于肿瘤化疗高尿酸血症的治疗和预防，但该方法表达的重组尿酸氧化酶以可溶解的活性形式聚集在胞内空隙中，这增加了提纯到药用级的难度，并且利用酿酒酵母作为宿主菌，会出现糖基化修饰过度的问题，这也增加了蛋白后处理的难度。

目前国内外关于尿酸氧化酶在酵母中异源表达的研究，主要集中在胞内表达或采用酿酒酵母来源的α-因子作为信号肽来实现尿酸氧化酶的胞外分泌，但是研究发现采用α-因子作为信号肽胞外分泌量较低，无法实现最终的产业化，而胞内表达分泌纯化成本较高。

因此，目前存在的问题就是构建一株能够实现尿酸氧化酶向胞外高分泌的菌株。

发明内容