[发明专利]一种自主构建的SLA-2-HB01-pCDH/sT2细胞系筛选CTL表位方法

说明书

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种自主构建的SLA‑2‑HB01‑pCDH/sT2细胞系筛选CTL表位方法。本发明将外源的SLA‑2‑HB01基因转染到sT2细胞，建立了稳定SLA‑2基因表达模型。经过细胞表面负载EB155等阳性表位肽，通过FACs检测细胞表面表达的SLA‑2‑peptides‑β2m复合体，判定SLA‑2‑HB01‑pCDH/sT2具有递呈外源性多肽表位的功能。为了促进细胞表面复合体的形成，添加β2m有助于抗原多肽递呈效率的提高。本发明结果中，As63、EB155和Hu62肽类均能够被SLA‑2‑HB01‑‑pCDH/sT2细胞系递呈，其中As63在SLA‑2‑HB01‑pCDH/sT2、SLA‑2‑HB01‑Flag‑pCDH/sT2和SLA‑2‑HB01‑3×Flag‑pCDH/在sT2细胞系中均被递呈且递呈效率基本一致，说明本发明构建的系列表达SLA‑2‑HB01基因的sT2具有递呈抗原的功能，从而可以用以在细胞水平上筛选猪源病毒的多肽表位，也进一步证明了SLA‑2重链分子C‑末端添加Flag标签不会影响细胞系的抗原递呈功能。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种自主构建的SLA-2-HB01-pCDH/sT2细胞系筛选CTL表位方法。

背景技术

传统疫苗对猪源病毒，如口蹄疫病毒，难以控制并容易产生人畜共患病的现象，因此研制新型安全的疫苗是目前研究的重点之一。随着免疫学与生物信息学不断融合发展，利用病毒抗原预测SLA-2限制性CD8⁺CTL表位，进而构建多肽表位疫苗是研究热点。所以如何选择合适的病毒抗原表位是重中之重。

表位(epitope)也称抗原表位，抗原决定簇，抗原分子中决定抗原特异性的化学基团，能与TCR或BCR特异性结合的基本单位，最终激起机体的免疫反应形成对病原微生物的免疫能力。表位通常包括B细胞表位、Th表位和CTL表位。其中，在宿主细胞内CTL表位与感染病毒的免疫应答直接相关，激发的杀伤性T细胞免疫预防效果最显著，因此也成为当今病毒表位研究的热点。

CTL表位是抗原蛋白与MHC I类分子结合并被TCR特异性识别，诱导CD8⁺CTL产生免疫反应的短肽。T细胞表位由MHC I类分子递呈到细胞表面，被TCR识别形成三分子复合体，激活相应的CD8⁺T细胞转化为致敏性CTL发挥细胞毒性作用杀伤靶细胞。

目前，筛选CTL表位的技术有很多，常用的方法有：

MHC四聚体(MHC tetramer)技术：Altman等人借助生物素(biotin)-亲和素(avidin)级联放大反应原理提出的。该技术根据生物素与亲和素4:1的特异性结合关系，利用生物素-蛋白连接酶(Biotin-protein ligaseA,BirA)能识别蛋白的特异序列，在MHC分子α链N端加入1个识别生物素的BirA酶底物肽序列，BirA酶可催化生物素结合到pMHC上，4个纯化的pMHC单体与1个亲和素标记的链霉素形成四聚体复合物，从而提高pMHC与TCR的亲和力，并通过灵敏度较高的FACs对抗原特异性T淋巴细胞进行快速的检测和分离。

噬菌体展示技术(phage display technique,PDT)：用于筛选和改造抗原多肽的技术，将外源性蛋白或抗体可变区与噬菌体表面特定蛋白融合，构建蛋白库并筛选亲和性较高的特异性蛋白的基因工程技术。此技术库容量大，但特异性和敏感性较低，不能实现全蛋白分子的表达。该方法只能进行B细胞表位和Th表位的筛选，而不能进行CTL表位筛选。

体外构建重链和轻链复合物筛选：在体外模拟多肽表位与MHC I类分子α链分子在体内的结合方式也可以实现限制性多肽表位与MHC I类分子的体外结合。这种结合有两种方式：一种是多肽表位与单表达MHC I类分子α链和β2m链结合；第二种是多肽表位与MHC I类分子复合物结合。