[发明专利]唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP恒温快速检测方法

说明书

本发明提出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP恒温快速检测方法，步骤有：1、准备待测DNA样品及LAMP恒温扩增特异性引物；其中LAMP恒温扩增特异性引物是选取唐菖蒲伯克霍尔德氏菌特异性基因序列进行合成得到，该基因采用唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)水解酶cayF基因；所述LAMP恒温扩增特异性引物为：外引物F3、外引物B3、内引物FIB、内引物BIP、环引物LF、环引物LB；2、采用LAMP恒温扩增反应体系对待测DNA样品进行LAMP恒温扩增，检测扩增产物的荧光信号，得到检测结果。本发明对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌特异性好、灵敏度高，可用于食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体是涉及一种用于检测食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP恒温扩增方法。

背景技术

椰毒假单胞菌酵米面亚种(Pseudomona cocovenenans)是1977年在东北酵米面中毒食品中发现的新的食品中毒菌，在2003年被划分为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)的一个病原型。谷类发酵制品(发酵玉米面、糯玉米汤圆粉、玉米淀粉、发酵糯小米、醋凉粉等)，变质银耳，薯类制品(马铃薯粉条、甘薯淀粉、山芋淀粉等)容易受到该菌的污染。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌可产生毒黄素和米酵菌酸，能引起高致病性的食物中毒。由该菌产生的米酵菌酸毒素引发的食物中毒事件在我国部分地区常有发生。据不完全统计，我国多个省都曾出现由该菌引起的食品中毒案例。1975年，我国东北三省因酵米面中毒226起，平均死亡率38.1％；1990～2006年广西因酵米面中毒121人，死亡率高达62.81％；2012年和2014年云南省红河州和文山州发生的两起居民食用变质玉米面汤圆和吊浆粑导致中毒死亡；2018年广东省河源市和东莞市也接连发生了因食用河粉引起中毒事件。

目前对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的检测主要采用传统生理生化和免疫学方法，例如国标方法(GB 4789.29-2020)检测包括增菌、分离纯化、生化鉴定、血清鉴定、毒理试验，检测操作步骤繁琐、耗费时间长，检测效率低，在重大食品安全保障任务或突发食品中毒事件中，传统的检测方法难以满足对食品的安全性提供及时准确的判断要求。LAMP检测技术，全称为环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)主要是利用具有链置换特异性的Bst DNA聚合酶和4～6条能够特异性识别靶标序列上多个特异性区域的引物，开启循环链置换反应，从而实现等温条件下的连续快速反应。该技术具有特异性强、灵敏度高、检测成本低、所需设备及人员要求不高，操作简单，反应时间短等优点。

综上，非常有必要建立一套特异性好、灵敏度高的食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP恒温扩增方法，应用于食品安全监督检验、保障性检验及突发食品安全事件应急检验等领域。

发明内容

本发明的目的是提出一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP恒温快速检测方法，其对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌特异性好、灵敏度高，可用于食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP恒温快速检测方法，其包括有以下步骤：

步骤1、准备待测DNA样品，以及准备对待测DNA样品进行LAMP恒温扩增的LAMP恒温扩增特异性引物；

所述待测DNA样品经超微量分光光度计测定后，其A260/A280在1.7-2.0之间，DNA浓度＞10ng/μL，于-20℃保存备用；

所述LAMP恒温扩增特异性引物是选取唐菖蒲伯克霍尔德氏菌特异性基因序列进行合成得到，所述唐菖蒲伯克霍尔德氏菌基因采用：唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderiagladioli pv.cocovenerans)水解酶cayF基因；所述特异性基因序列在唐菖蒲伯克霍尔德氏菌水解酶cayF基因中第195bp-389bp位置。