[发明专利]抗血液肿瘤药物活性成分的获得方法及其用途

说明书

本发明公开了治疗/预防血液肿瘤药物活性成分的获得方法。该方法中，首次对NK‑92细胞、NK‑92MI细胞分泌的细胞外囊泡进行三级分离，获得两组包括大中小三种尺寸的细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)；然后利用NK‑92细胞、NK‑92MI细胞的微小RNA(miRNA)序列和两组细胞外囊泡的miRNA序列组成的大样本进行活性筛选，获得对血液肿瘤细胞杀伤力强的活性miRNA。通过本发明获得的活性miRNA可参与调节基因的表达，具有治疗/预防血液肿瘤的作用；这些活性miRNA可能调节免疫细胞的早期发育，影响免疫细胞发育及分化；活性miRNA可能参与免疫功能的调控，对血液肿瘤具有治疗/预防作用。本发明提出的活性miRNA在脂质体中的转染效率高，转染后的抗肿瘤效果显著。

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及相关的活性成分在制备治疗/预防白血病药物上的用途。

背景技术

血液系统恶性肿瘤(Hematological Malignant Tumors)是一种血液系统恶性疾病，具有高度恶性和分化障碍等特点，包括急、慢性白血病及淋巴瘤等。慢性粒细胞白血病(Chronic Myelocytic Leukemia，CML)是一种发生在多能造血干细胞上的恶性骨髓增殖性肿瘤。其特点是产生大量不成熟的白细胞，这些白细胞在骨髓内聚集，抑制骨髓正常造血功能，并能够通过血液在全身扩散，导致病人出现贫血、容易出血、感染及器官浸润等。目前白血病的治疗方法主要包括化疗、局部放疗、靶向治疗、中药治疗和骨髓移植等，然而存在药物治疗效果欠佳、骨髓移植费用昂贵、容易产生耐药及复发等棘手问题。因此，临床上亟需能够有效治疗/预防血液肿瘤/白血病的新型活性成分和新型药物。

自然杀伤细胞(Natural Killer cells，NK细胞)来源于骨髓淋巴样干细胞，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结等组织器官中。NK细胞不同于T细胞和B细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞。NK-92是生长、增殖依赖于IL-2的人源性NK细胞株，NK-92MI是源自NK-92细胞株、经基因转染得到的IL-2非依赖性NK细胞株。两株人源性NK细胞株可以方便和经济地实现稳定、大量、长期扩增，并已被证实对很多恶性肿瘤具有细胞毒性。细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡的统称。科学家们最早于1983年从绵羊网织红细胞中分离出携带亲本细胞成分的细胞外囊泡，其后细胞外囊泡陆续在血液、尿液、羊水、唾液等体液中被发现和报道。细胞外囊泡通常携带母细胞内的重要生物活性物质，例如蛋白质、mRNA、miRNA和脂质等，能够通过与靶细胞的结合而调控细胞功能，参与细胞间交流。

本发明利用两种人源性NK细胞株NK-92和NK-92MI作为获取NK细胞分泌的细胞外囊泡的来源。

发明内容

鉴于上述背景技术，本发明的目的是提供一种活性成分的获得方法及其在制备治疗/预防白血病药物上的用途。

经研究，本发明提供如下技术方案：一种用于制备抗血液肿瘤药物的活性成分的获得方法，包括：

1)将以下8组miRNA进行差异表达分析，筛选出差异倍数显著或平均表达量高的miRNA；8组miRNA为：NK-92表达的miRNA、NK-92MI表达的miRNA、NK-92细胞外囊泡LEV表达的miRNA、NK-92细胞外囊泡SEV表达的miRNA、NK-92细胞外囊泡EXO表达的miRNA、NK-92MI细胞外囊泡LEV表达的miRNA、NK-92MI细胞外囊泡SEV表达的miRNA、NK-92MI细胞外囊泡EXO表达的miRNA。

2)将步骤1筛选出的miRNA，基于差异倍数或平均表达量的高低进行排序，筛选出差异倍数高或平均表达量高的活性miR-X。

进一步地，本发明提供上述NK-92的细胞外囊泡LEV、SEV与EXO，以及NK-92MI的细胞外囊泡LEV、SEV与EXO的获得方法，具体为：