[发明专利]位阻调控的单分子自闪烁荧光染料的合成与应用

说明书

本发明提供了一类用于单分子荧光成像的自闪烁荧光染料及其合成，该染料中引入的大位阻酰胺能够调节罗丹明染料的分子内螺环化反应平衡，实现该染料在正常生理条件下自发的在荧光与非荧光状态之间的转换，从而实现单分子荧光成像，染料结构如(1)所示；与现有自闪烁荧光染料相比，该染料不依赖对氧杂蒽结构上电子效应的调节实现分子内螺环化反应的调节，而是在螺环处引入大位阻酰胺，利用位阻效应调节螺环化反应平衡，因此该染料可以在几乎不改变氧杂蒽母体吸收波长、发射波长和荧光量子产率的前提下实现自闪烁，且易于合成与功能化，在单分子成像领域具有良好应用前景。

技术领域

本发明属荧光染料设计领域，具体涉及一种用于单分子荧光成像的自闪烁荧光染料及其合成。

背景技术

荧光显微镜一直是生物学领域研究的重要工具，然而传统的荧光显微镜受到衍射极限的限制，无法分辨200nm以下的超微结构。超分辨荧光显微镜利用时间换空间的策略，能够突破衍射极限的限制，大幅度推动了生物微观领域的研究，是一种前所未有的研究工具。目前的超分辨荧光显微镜技术主要有结构光照明显微镜(SIM)、受激发射损耗显微镜(STED)、随机光学定位重构显微技术(STORM)等。而这些技术实现衍射极限的突破在很大程度上依赖于能够在荧光态和非荧光态转变的具有“开-关”性质的荧光染料。其中，自闪烁荧光染料由于其不依赖外源添加剂和强激光就可以实现“开-关”性质，相比于其他染料在活细胞成像领域有巨大优势。

当前自闪烁染料分子的设计方法通常是利用调节氧杂蒽环上取代基的推拉电子能力来对“开-关”进行调控，而氧杂蒽环上取代基的改变，会直接影响到荧光分子的吸收波长、发射波长和量子产率等光性能，这导致目前很难将光性能优异的分子在保留原有光性能的条件下转变为自闪分子，而现有分子在成像过程中又面临着波长难以调节、量子产率低和不易于衍生的问题，难以满足活细胞成像过程中的复杂需要，所以急需新的自闪分子的设计方法以开拓多色、易于调控、功能化的自闪荧光染料。

发明内容

本发明提供一种用于单分子荧光成像的自闪烁荧光染料及其合成和应用，该荧光染料能够在不同pH条件下实现自闪烁。

本发明提供一种用于单分子荧光成像的自闪烁荧光染料，该荧光染料利用位阻调节分子荧光态与非荧光态平衡，不影响荧光母体的光性能。

本发明提供一种用于单分子荧光成像的自闪烁荧光染料，该荧光染料是用于单分子荧光成像的自闪烁荧光染料，以罗丹明为荧光基团，-2-氨基-2-甲基-1-丙醇为调节基团，该系列荧光染料具有如下结构：

其中R₁分别为中的一种或二种以上；

R₂分别为H或中的一种或二种；

或，R₁、R₂为C，C为

一种用于单分子荧光成像的自闪烁荧光染料的合成方法，此系列探针合成路线，如下：

具体合成步骤如下：

SSR-2的合成：

将罗丹明和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和三乙胺的混合溶剂中，室温下搅拌20-30min；之后在搅拌下加入2-氨基-2-甲基-1-丙醇，室温反应12-15h；反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经200-300目硅胶柱以体积比5:1-3:1的石油醚和乙酸乙酯为展开剂分离纯化得到白色粉末状固体SSR-2。其中：

罗丹明类化合物与2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的质量比为1:1.0-1.6；

罗丹明类化合物与N,N-二甲基甲酰胺的质量与体积比为1:21-241g/mL；