[发明专利]一种细菌漆酶变构体及其制备方法在审
| 申请号： | 202111496402.1 | 申请日： | 2021-12-09 |
| 公开（公告）号： | CN113999826A | 公开（公告）日： | 2022-02-01 |
| 发明（设计）人： | 兰善红;刘金环;胡俊杰;吕小梅 | 申请（专利权）人： | 东莞理工学院 |
| 主分类号： | C12N9/02 | 分类号： | C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19 |
| 代理公司： | 广州高炬知识产权代理有限公司 44376 | 代理人： | 景梅 |
| 地址： | 523000 广东省*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 细菌 漆酶变构体 及其 制备 方法 | ||
1.一种细菌漆酶变构体，其特征在于：所述细菌漆酶变构体的氨基酸序列相较于SEQID NO.1所示的野生型细菌漆酶的氨基酸序列存在至少一个缺失片段；所述缺失片段被移除后，不改变由His443，Cys500和His505所形成的Cu1的空间结构。
2.根据权利要求1所述的细菌漆酶变构体，其特征在于：所述的缺失片段为野生型细菌漆酶序列中形成R-loop结构或MR螺旋的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的细菌漆酶变构体，其特征在于：所述缺失片段的位置为SEQ IDNO.1所示的野生型细菌漆酶的氨基酸序列的61-68、128-140、198-206、256-264、313-322或373-385号位中的任意一个位点。
4.根据权利要求1所述的细菌漆酶变构体，其特征在于：所述细菌漆酶变构体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.9所示序列的任意一种。
5.一种编码如权利要求1-4任一项所述的细菌漆酶变构体的核酸序列。
6.根据权利要求5所述的核酸序列，其特征在于：所述的核酸序列为SEQ ID NO.11-SEQID NO.18所示序列的任意一种。
7.一种工程菌，其特征在于：所述的工程菌中含有权利要求5中所述的核酸序列。
8.一种工程菌，其特征在于：所述的工程菌中含有权利要求1-4任一项所述的细菌漆酶变构体。
9.一种如权利要求1-4任一项所述的细菌漆酶变构体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1、获取序列：以大肠杆菌来源的漆酶CueO的晶体结构为原型，通过AutodockVina、RosettaFold、PyMOL、Procheck软件进行蛋白质辅助设计，得到细菌漆酶变构体、序列结构与基因序列；
步骤2、合成漆酶基因：根据宿主菌株的密码子偏爱，合成得到含偏爱密码子优化的细菌漆酶变构体的基因的克隆载体质粒pUC-GW-Kan及其宿主菌株；
步骤3、提取漆酶基因模板：对含克隆载体质粒的宿主菌株进行培养、收集，提取质粒，得到含细菌漆酶变构体的基因模板的载体pUC-GW-Kan；
步骤4、构建重组载体：通过酶切连接法将细菌漆酶变构体的基因与pET28a+质粒连接构建重组载体，得到重组载体；
步骤5、构建重组菌株：将重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞中，得到重组菌株；
步骤6、诱导培养：用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG诱导培养重组菌株，并加入硫酸铜进一步培养诱导培养，并提取蛋白；
步骤7、漆酶活性的测定：使用ABTS法测定漆酶活性。
10.根据权利要求9所述的细菌漆酶变构体的制备方法，其特征在于：步骤5所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21 DE3菌株。
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