[发明专利]一种基于Cas14和链置换扩增的miR-21检测试剂盒及其应用有效

专利信息
申请号: 202111495591.0 申请日: 2021-12-08
公开(公告)号: CN114196752B 公开(公告)日: 2023-08-08
发明(设计)人: 钱钧;张婷;张骞 申请(专利权)人: 福州市讯刊生物科技有限公司
主分类号: C12Q1/6886 分类号: C12Q1/6886;C12Q1/6851
代理公司: 武汉谦源知识产权代理事务所(普通合伙) 42251 代理人: 尹伟
地址: 350000 福建省福州市闽侯县*** 国省代码: 福建;35
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摘要:
搜索关键词: 一种 基于 cas14 置换 扩增 mir 21 检测 试剂盒 及其 应用
【说明书】:

发明涉及一种用于检测miR‑21的试剂盒,包括模板、Cas14a、sgRNA、报告单链DNA、DNA聚合和核酸内切酶,所述sgRNA序列如SEQ ID NO:2所示,所述模板的序列如SEQ ID NO:4所示。本发明针对miR‑21构建了一个专门的Cas14‑SDA体系,该体系可特异地精确定量检测包括临床样品在内的miR‑21的含量,并且可用于区分胆管癌患者和健康人员。

技术领域

本发明涉及小分子RNA检测和胆管癌诊断领域,更特别地,涉及一种基于Cas14a和链置换扩增的miR-21检测试剂盒及其应用。

背景技术

胆管癌是最常见的肝脏恶性肿瘤之一,在患者有临床症状时常已进展到晚期。因此需要一种能够在早期筛查发现胆管癌方法。

miRNA是一种短RNA,通过与mRNA相互作用调节蛋白质的表达。根据已有研究,miRNA与细胞的生长、分裂和癌变等都息息相关,参与细胞的几乎所有关键过程。此外,有研究发现,一些miRNA的表达水平与相关疾病联系密切,可用作相关疾病的检测标记。目前,miR-21已经被证实与胆管癌的发生有关,尤其是,循环miR-21水平可指示胆管癌的进展阶段。因此,可通过检测循环miR-21水平来早期诊断胆管癌。

最常用的miRNA检测方法主要是northern blotting、microarray analysis和qPCR。其中,Northern blotting是miRNA检测的黄金方法,微量分析可以高度复用,但通常对血液中低含量的miRNA检测不够灵敏。qPCR具有较高的灵敏度,但miRNA的短序列特性使得qPCR引物的设计变得复杂。此外,qPCR的仪器昂贵,阻碍了其应用。等温扩增技术已被用于miRNA的检测,并极大地促进了miRNA图谱分析工具的发展。以miRNAs为引物或模板,设计了滚动圆扩增、环介导等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)和指数扩增反应检测miRNAs,并结合荧光、电化学以及电化学发光传感平台,可实现对miRNA的高灵敏度检测。然而,由于缺乏精确鉴定扩增子的程序,扩增过程可能有助于miRNAs的非特异性扩增。

CRI SPR-Cas系统是为免疫细菌而进化产生,现已发展为用于核酸检测。Cas12a、Cas13a等CRISPR-Cas系统可以通过与靶基因或RNA结合引发特异性激活。Cas蛋白的激活可以切割单链RNA或DNA序列,称为反式切割过程。CRISPR-Cas系统通过荧光团和猝灭基团标记短的DNA/RNA序列,可以作为核酸扩增的报告器,如PCR,或包括重组酶聚合酶扩增(RPA)和LAMP等等温扩增。而Cas12a和Cas13a则需要具有明确核苷酸的靶序列,如Cas12a需要TTTV等原生间隔邻近基序。然而,最近的报道表明Cas14a具有不受核苷酸限制的识别序列的能力。在这里,我们引入CRISPR-Cas14a作为等温扩增SDA的报告器,从而实现了一种快速、等温检测胆管癌肿瘤标志物miR-21的方法。SDA的设计非常简单,只需要一个DNA序列作为模板。通过CRISPR-Cas14a可以严格检测靶miRNA触发的扩增。miRNAs的检测可以在1小时内完成。我们使用Cas14SDA检测胆管癌患者和健康人的血液样本。快速、简单的Cas14SDA检测可促进mi RNA的转化,为临床诊断提供依据。

发明内容

为解决以上问题,本发明提供了一种用于检测miR-21的试剂盒,包括模板、Cas14a、sgRNA、报告单链DNA、DNA聚合和核酸内切酶。

在一个具体实施方案中,所述sgRNA序列如SEQ ID NO:2所示。

在一个具体实施方案中,所述模板包括三个结构域,依次为:mi R-21结合结构域、内切酶识别切割结构域和Cas14a激活结构域。

在一个具体实施方案中,所述模板的序列如SEQ ID NO:3所示。

在一个具体实施方案中,所述核酸内切酶为Nt.BstNBI。

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